Индуцт ОЦТ јетра С9 Фракција јетре: систем активирања метаболизма за ин витро генотоксичност и испитивања мутације

Кључне речи: ОЕЦД 471, ОЕЦД 473, ОЕЦД 476, ОЕЦД 487, тест мутације, генотоксичност, генетска токсичност, изазвани пацов јетра С9, АМЕС тест, Мини Амес тест, хромосомска аберација, микронуклеус, хпрт / хгпрт тест, ТК тест

Ифасе производ

Увођење

Изазвани пацов јетра С9је кључна компонента у проценигенетска токсичностПотенцијал хемикалија, посебно у регулаторној токсикологији. Обично се користи у комбинацији са ин витро испитивањем, као што јеАМЕС тест иТестови мутације, за процену мутагених својстава једињења. Омогућавањем ензимским системом богатим цитокромом П450 (ЦИП450), фракција изазване пацове С9 игра пресудну улогу у симулацији метаболичких процеса који се јављају у јетри, помажући да ли хемикалије могу потенцијално изазвати генејске мутације или рак.

Изазвани пацов јетра С9

Фракција јетре С9 односи се на пост - митохондријски супернатант добијен од хомогената јетре пацова након низа центрифугиративних корака. Израз "индуковано" односи се на лечење пацова са специфичним једињењима која побољшавају активност јетрених ензима, посебно цитохроме П450 ензима (ЦИП450), који су одговорни за метаболизам широког спектра ксенобиотика.

Узгости фракција јетре пацова С9 садржи различите ензиме који су укључени у фазу И и фазу ИИ метаболизам хемикалија. Ово укључује ензиме као што су цитохроме П450 монооксигеназе, које олакшавају оксидативне биотрансформације подлога, на тај начин опонашају метаболизам људске јетре.

Цип450 активност и метаболичка активација

Породица цитокрома П450 ензима (ЦИП450) игра кључну улогу у метаболизму широког спектра супстанци, укључујући многе фармацеутске, еколошке хемикалије и карциногене. Узроковани фракција јетре пацова С9 садржи ове ензиме и од суштинског је значаја за оцењивање хемикалија које могу постати само генотоксични након активирања метаболизма.

Многа једињења су у почетку непроменљиви -, али могу постати токсични након метаболизма у јетри. Ови про - мутагене (који захтевају метаболичка активација да постану мутагенике) и про - канцерогени (који захтевају активирање за проузрочавање рака) може се препознати само путем испитивања који укључују систем активирања метаболизма С9. Без индукције метаболичких ензима попут ЦИП450, ове супстанце се могу чинити безопасно у стандардним тестовима генотоксичности.

Додавањем изазване јетре пацова С9 у витро испитивање, истраживачи могу да процене како супстанца упише са ензимима ЦИП450. Ово је посебно важно за лекове, јер метаболизам ЦИП450 ензима је критични корак у фармакокинетици многих лекова.

Апликације изазване јетре пацова С9

1. 1. АМЕС тест (ОЕЦД 471)

Тест АМЕС-а, описани у смернициОЕЦД 471, једна је од најпознатијих и широко коришћених метода за процену мутагености. То укључује излагање сојева бактерија са салмонеле у тест хемикалија да би се видело да ли индукује мутације које узрокују да се бактерије врате на хистидинску - независну државу.

Да бисте симулирали људски метаболички процес, изазвани јетру пацова С9 често се додаје у тестни систем. С9 фракција пружа потребне ензиме, укључујући ЦИП450, који ће можда бити потребно да се метаболизује једињење у реактивнији облик који би могло изазвати мутације у бактеријском ДНК. Ова комбинација С9 са АМЕС тестом омогућава свеобухватнију процену мутагеног потенцијала опонашањем директних и метаболички активираних мутагених механизама.

2. 2.Испитивања мутације (тест хромосомских аберација, тест микронуклеус и други ин витро тестови)

Поред теста АМЕС-а, тестови мутације се обично користе за процену генотоксичног потенцијала хемикалија. Ови тестови су свеобухватнији у процени палета генетске штете, укључујући хромосомске мутације, мутације гена и формирање микронуклеула. Изазвани пацов јетра С9 користи се у испитивањима мутације из следећих разлога:

Микронуклеус тест (ОЕЦД 487)

Овај тест открива формирање микронуклеија у ћелијама, које су мале, ваннуклеарне тела које садрже фрагменте хромозома или целих хромозома који нису уграђени у језгро током одељења ћелијске ћелије. Тхе Микронуклеус тестМоже да открије кластогене (ломљење хромозома) и анеугенично (који утичу на број хромозома). Овде се користи индукована јетра пацова С9 да активира метаболички активирање тестне супстанце, јер неке хемикалије узрокују само хромозомалну штету након што их је метаболизирала ензимима јетре. С9 фракција повећава сензибилитет теста симулирајући метаболичка активација која се може појавити ин виво.

Цхромосомал Аберацијски тест (ОЕЦД 473)

Овај тест оцењује да ли супстанца може проузроковати структурно оштећење хромозома индуковањем паузе, брисања, трансформација или других врста аберација. Попут микронуклеус теста, тхе тхеЦхромосомска тест аберацијеМоже се применити са или без метаболичке активирања. Изазвани пацов јетра С9 додаје се у тестни систем да опонаша метаболички процеси у јетри, омогућавајући процену супстанци које можда неће изазвати хромозомалну штету у свом изворном облику, али могу то да ураде након метаболизма јетре.

Табела 1. Упоредна разматрања испитивања мутације

ХПРТ / ХГПРТ тест (ОЕЦД 476)

УХПРТ / ХГПРТ тест, Културе кинеског хрчка (ЦХО или В79) или људских лимфобластоидних (ТК6) ћелија су изложене тестирању хемикалије у присуству индуковане метаболичке мешавине изазване јетре пацова, која испоручује ЦИП450 ензими потребни за претварање про-мутагена у ДНК-реактивне врсте. Након кратког третмана и седмодневног периода експресије, ћелије су изазване са 6-тиогуанином; Преживљавају само клонове са губитком функција у хипоксантин-гуине фосфорибозилтрансферазе. Упоређивањем тачкеталне колоније до укупне одрживости, истраживачи одређују фреквенцију мутације да, ако се репродуктивно повисила преко истодневне и историјске контроле, указује на генотоксични потенцијал.

ТК тестови (ОЕЦД 490 & ОЕЦД 476)

ТхеТК тест запошљава или Л5178И миша лимфома ћелија (ОЕЦД 490) или ЦХО ћелије (ОЕЦД 476) Конструисан хетерозиготан на локусу тимидин киназе. Након хемијске експозиције ± С9 мик, ћелије се опорављају и постављају се у медијуму који садржи трифлуоротимидин, који убија ћелије за профине ТК. Преживели ТК⁻ мутанти формирају колоније преко 10-14 дана, а мутанти мале колоније често одражавају хромосомске догађаје и бојанте велике колоније који одражавају тачке мутације. Као и у тесту ХПРТ / ХГПРТ, строга контрола цитотоксичности и позитивна муташки мерила осигуравају да је посматрано повећавање фреквенције мутације поуздано одражавају једињење генотоксични ризик једињења.

4. 4. Процена ризика од рака

Изазвани пацов јетра С9 такође се користи у студијама које имају за циљ да процени рак - узрокујући потенцијал супстанци. Симулирањем метаболичких процеса који се јављају у људској јетри, С9 фракција може помоћи у препознавању једињења која би могла довести до стварања реактивних метаболита способних да се обавезују за ДНК и изазивају мутације које би могле довести до рака.

Побољшани АМЕС тест са изазваним јетром јетре хрчка С9

Према најновијим смерницама које издају Агенција за европску лекове (ЕМА), традиционални АМЕС тест можда није довољно осетљив да открије мутагени потенцијал одређених Н - нитрозаминских нечистоћа, посебно Н - нитросодиметиламиламина (НДМА). Стога је побољшани АМЕС тест, који је развио Национални центар за токсиколошка истраживања (НЦТР), подјела У.С. Управе за храну и лекове (ФДА), препоручена је као поузданија алтернатива. Побољшани АМЕС тест је увео додавање изазваног јетре Харстера С9, који је наступио у јетри 30% пацова С9 и 30% јетре хрчка С9. О пацова и хрчка десмосомалне супернатанте (С9С) треба да буду припремљени од лике на глодару третиране цитохромним П450 ензимом - који индукује супстанце. Коришћењем изазваног јетра јетре Харстера С9, овај побољшани тест боље симулира људски метаболизам и повећава поузданост резултата.

Закључак

Изазвани пацов јетра С9 служи као критично средство у тестирању генотоксичности, помагање истраживачима и регулаторним агенцијама процењују мутагени и канцерогени потенцијал хемикалија. Омогућавањем метаболичког система активирања, он повећава способност испитивања попут теста АМЕС-а, испитивања мутације и студија активности Цип450 за откривање супстанци које захтевају метаболичка активација да постану генотоксични. Његове примене су неопходне за обезбеђивање сигурности нових лекова, хемикалија и потрошачких производа. Својим улогом у симулацији метаболизма људске јетре, индуктор фракција С9 јетре пацова и даље је неопходан део савремене токсикологије и процјене безбедности регулаторних безбедности.