Примарни хепатоцити: Кључни алат за унапређење небицичко-клиничких истраживања ин витро лекова

Примарни хепатоцити: Кључни алат за унапређење небицичко-клиничких истраживања ин витро лекова

Јетра, као примарни орган за излагање лековима, игра пресудну улогу у метаболизму дрога и процесима токсичности. Примарни хепатоцити поседују цео спектар ћелијских карактеристика и физиолошких нивоа ензима и кофактора, укључујући мембране - везане ензиме као што су цитоцхроме П450 (мешовитих - функција оксидаза у глатком ендоплазмичком ретикулуму) и цитосолизмичким ретикулума, а обухватајући све метаболичке путеве налазе се у јетри. Из тог разлога, примарни хепатоцити се широко сматрају златним стандардом за изградњу ин витро модела јетре и фаворизовани су истраживачима у интеракцији лекова, метаболизма лекова и студијама токсичности. Овај чланак пружа преглед модела 2Д и 3Д културе заснован на примарним хепатоцитима и њиховим пријавама у развоју лекова.

Кључне речи: примарни хепатоцити, 2Д култивација, 3Д култивација, органоиди, ЦО - култура.

1. 1. Изолација примарних хепатоцита

Изолација примарних хепатоцита је критични корак у успостављању ин витро модела јетре, са две - корака колагеназе перфузијска метода која се најчешће користи. На мањим животињама, јетре се перфузија може извести преко порталне вене или инфериорне вене каве, док веће животиње обично захтевају перфузију кроз јетрене режњеве или сегменте. Неколико кључних фактора утиче на успешну изолацију хепатоцита: прво, колагеназа треба да буде цитотоксична. Друго, време варења је пресудно-И под - дигестијом и прекомерно дигестију могу угрозити принос и одрживост хепатоцита. Треће, стање јетре мора бити оптимално, јер су хепатоцити веома осетљиви на исхемијску штету. Јетра која се користи за припрему хепатоцита треба брзо охладити да би се смањила метаболичке стопе и спречила метаболичку хипоксију и следећу исхемију.

Стандарди за примарне хепатоците који се користе у истраживању лекова су следећи:

1. 2 Примарни ХЕПАТОЦИТЕ 2Д култура

Модел суспензије хепатоцита

Садржи комплетну ензиму за метаболизацију дрога - и капактори, што га чини погодним за проучавање различитих путева метаболичких путева. Међутим, одрживост суспензије хепатоцита и активност метаболизујућих ензима лека постепено се смањује док се ин витро време инкубација повећава, ограничавајући време инкубације на највише 4 сата. Овај модел се обично користи за процену чишћења лекова са умереним до високим брзинама чишћења. Када је стопа клинеса мања од 20%, не могу се утврдити тачна вредности за уклањање. Традиционална суспензија ХЕПАТОЦИТЕ - на бази метаболизма ВИТРО нису довољни за генерисање метаболичних реакција за споро - ограничавање њихове способности да предвиде стопе за чишћење и метаболички производи од ових једињења. Метода релеја хепатоцита огибљење (слика 1) може се користити за продужење времена инкубације на 20 сати или чак дуже.

Примена:Ензимске активности и студије метаболичке стабилности за мале молекуле лекове.

Слика 1. Суспензија Хепатоците поступак преноса релеја

Извор: Одлагање метаба лека, 2012.,40 (9): 1860-1865

Модел хепатоцита доплава

Примарни хепатоцити се култивирају у 2Д систему на целокупним грађевинским плочама. Хепатоцити показују епителну морфологију, са избоченим језграма, често представљајући у бинуклетирани облик. Недостаци појединачних монолаиер културе Хепатоците укључују: 1. Измена ћелијске поларитета и функције.2. Недостатак других релевантних типова ћелија (тј. Не. "Не - парехималне ћелије) које су потребне за нормалну функцију.3. Немогућност пружања довољних хранљивих састојака и паракрина фактора да подрже хепатоците у обављању својих функција (као што су жучна киселина и биосинтеза протеина у серуму).

Апликације:

1). Евалуација лекова - Интеракције лекова:Ово укључује индукцију ензима, инхибицију ензима и студије транспортера. Прво, када лек делује као индуктор, то може довести до повећаног изражавања метаболизације дроге - и транспортера. Снажне индукције могу истовремено да регулишу више гена, као што су фенобарбитални индукција ЦИП2Б6, ЦИП3А4, ЦИП2Ц9, УГТ и неколико транспортних протеина попут МРП2. Друго, постоје врсте - специфичне разлике у томе како хепатоцити реагују на индукцију. На пример, Рифампицин је ефикасан индуктор за људске и зечеве хепатоците, али нема индукцијског ефекта на пацове хепатоците. Коначно, субоптимална густина навлаке хепатоцита који доводе доплаву може довести до смањеног базалног изражавања П450С и вештачки повећаних индукцијских одговора. Као што је приказано на слици 3, хепатоцити на нижим густини на плочама показују нижу базалну активност ЦИП1А2, ЦИП2Б6 и ЦИП3А4, али јаче индукцијске одговоре. Стога су здрави хепатоцити на одговарајућој густини накупљања неопходни за добијање физиолошки релевантних података.

Слика 2. Однос између густине преноса криопресурених хуманих хепатоцита и индукције ензима

Извор: Текуће технологије ДИСЦОВЕРИ ДИСЦОВЕРА 2010, 7: 188 - 198

2). Процена хепатотоксичности: Посматрање морфолошких промена под светлосним микроскопом, као што је ћелијска морфологија, вакуоле и липид агрегација капљице и причвршћивања ћелија / одреда. Откривање некрозе хепатоцита (као што је назначено аспартатом аминотрансферазе, лактат дехидрогеназа и аланин аминотрансфераза) и апоптоза (фрагментација ДНК). За цитокин - посредовану цитотоксичност, појединачне моноложне културе хепатоцита не могу предвидјети токсичне одговоре због прописе од стране супстанци ослобођених из суседних нерођених парехималних ћелија, попут Купффер ћелија, званичне ћелије и синусоидне ендотелне ћелије.

3). "Релаи метода" за проучавање спорог метаболизујућих очишћења и његових метаболита: Активност метаболизујућих ензима лекова - у хепатоцити који доплаве се почиње да се смањује након 24 сата облога. Након инкубације хепатоцита који доплаве са серумом - слободан медијум који садржи једињење камате током 24 сата, медијум је сакупљен и мешан, а затим пребачен на нове хепатоците доплате за даљу студију (Слика 3).

Слика 3. Процес преноса релеја који доплави хепатоците

Извор: Метаболизам лекова, 2016, 10: 3 - 15

3). Процијените ћелијски унос, ендоцитозу, ендосомално бијег и утичња на циљни ген хепатоцита циљане мале дроге на нуклеинској киселини.

Модел култивације сендвича

Ин витро, хепатоцити се могу култирати између два слоја колагена или матригела за реконструкцију ин виво структура, познатих као култивација сендвича. Хепатоцити култивисани између два слоја гела - колагена (сендвич структура) може побољшати морфологију и одрживост ћелија и одржавати своју функционалност дужем периоду. Поред тога, хепатоцити у сендвич култури могу вратити поларитет, омогућавајући правилно локализацију басколатералних и каналикирских транспорта, као и формирање функционалних мрежа од жучних канала (Слика 4).

Слика 4. Поларизовани израз транспорта у хуманом моделу сендвича од хепатоцита

Извор: Текуће технологије ДИСЦОВЕРИ ДИСЦОВЕРА, 2010, 7, 188 - 198

Апликације:

1. 1). Процена билијарног излучивања једињења.
2. 2). Процена јетре и билеарске дистрибуције ендогених и егзогених једињења и метаболита.
3. 3). Процењено одобрење посредовано метаболизмом и транспортом и изградња физиолошких фармакокинетичких модела.
4. 4). Проучавање хепатотоксичности и пружање механизама за клиничку лек - изазвана повреда јетре. Подаци су интегрисани у системе фармаколошке моделе да предвиде потенцијалну лек - изазвану повреду јетре код људи.
5.  
   1. 3. Примарно 3Д култура хепатоцита

6. У 3Д системима културе хепатоцити се култивирају у три - димензионалне матрице, који је боље опонашају ин виво архитектуру јетре у поређењу са 2Д монолаиер културама. Ови системи промовишу ћелију - ћелијске и ћелијске - интеракције - матричне интеракције, које могу вратити више физиолошких функција јетре, укључујући метаболизам лека, излучивање протеина и стварање жучних дела. Примарни хепатоците 3Д културе могу се користити за проучавање посебних функција јетре у више ин виво - попут окружења, нудећи предности за испитивање лекова, процене токсичности и моделирање болести.

   Модел сфероида

Кроз технике као што су ултра - ниска култура причвршћивања, виси културе од капи и магнетна ћелија (слика 5), примарни хепатоцити могу се агрегати у сфероидни агрегати пречника до 150 - 175 μм без ослањања на спољне матрице. Једна предност сфероидне културе је да сваки сфероид захтева само 1.330 - 2.000 ћелија, значајно смањујући број ћелија у поређењу с другим техникама 3Д културе. Недавне студије су показале да примарне култуле сфероидних хепатоцита могу одржати до 5 недеља, а ЦИП ензимска активност преостала је готово непромијењена између 8. и 35. дана. Протеомицс Анализа открила да је, у поређењу са сендвичом, ензимима за апсорпцију, дистрибуцију, метаболизам, и излучивање, боље сачувана у сфериизму. Међутим, јетра је много сложенија од агрегата ћелије. Басолотерална страна хепатоцита комуницира са крвљу, док жучи тече са апикалне стране, која је кључна карактеристика сложене структуре литре јетре и то се још не може поновити у моделу сфероида.

Апликације:

1. 1). Проучавање спорог покретачког клиренса и његових метаболита.
2. 2). Истраживање хепатотоксичности.
3. 3). Евалуација ћелијске уношења, ендоцитозе, ендосомалног бијега и утичница на циљане гене хепатоцита циљане су дроге са малим нуклеиним киселином.

Слика 5. Метода сфероидне културе

Модел јетрених орзона

Дефиниција консензуса органоида је: 3Д структуре изведене из ћелија матичних ћелија, прекривених ћелија, способних да репродукују одређене функције и структуре родног ткива ин витро, ефективно опонашају ин виво микроетирајуће и ћелијске интеракције. Орромаиди јетре идентификовани су као најнапреднији модел истраживања људске биологије.

Извори ћелије за грађење јетрених орзона:

① Плурипотентне матичне ћелије (ПСЦС):

Ембрионске матичне ћелије (ЕСЦС) и индуковане плурипотентне матичне ћелије (ИПСЦ) поседују високу плурипотентност, пластичност и неограничене пролиферативне капацитете. Под утицајем одређених сигналних фактора, разликују се у хепатоцит - попут ћелија са активностима и функцијом. Међутим, орзони јетре који су изведени од ПСЦ-а могу подвргнути епигенетним и генетским преинакињама, излагати промене хромосомских анеуплоидија током појачања.

Апликације:

1. 1). Модели генетске болести јетре
2. 2). Инфективни модели болести јетре
3. 3). Тестирање цитотоксичности на лековима

② Ћериране ћелије јетрене ткива - укључују холангиоците и хепатоците. Зрели хепатоцити задржавају потенцијал матичних ћелија и пролиферативне способности у одређеним окружењима. У поређењу са ПСЦ - изведеним орзонима, орзони који су изведени из примарног ткива су зрелији, са стабилнијим геномима и одржавају фенотипску и генетску стабилност током дугогодишњег рока ин витро култура. Међутим, дугорочни израз пролиферативни капацитет зрелог хуманог хепатоцита је ограничен у поређењу са феталним људским хепатоцитима или примарним хепатоцитима за одрасле миша. Култивално одрасли хепатоците Орромаииди остаје изазован.

Метода културе (Слика 6): Ткиво јетре се пробавља у појединачне ћелије, а мешавина матригела и ћелија је сеја у плочици од 24 - да би формирала структуре у облику куполе - Инкубирајте у инкубатору ћелијске културе (37 ° Ц) током 15 минута. Након учвршћивања, додајте одређени медијум за културу. Одломак након отприлике 14 дана. Замените оригинални медијум са медијумом диференцијације након 7 - 10 дана.

Апликације:

1. 1). Епатотоксичност Модели
2. 2). У студији поремећаја метаболизма ин витро метаболизам
3. 3). Необ. алкохолна масна болест јетре
4. 4). Развој дроге за бенигне и малигне болести јетре

Слика 6. Процес културе и пролаза од ткива - изведених јетрених орзона

Извор: Целл & Биосциенце (2023) 13: 197

Поређење културе сфероидне културе и органоидне културе

4. Примарни модел културе Хепатоците ЦО -

1. 1. 2Д Примарни Хепатоците Цо - Модел културе културе
      

      У 2Д примарном хепатоците Цо - Модел културе ЦОБЛЕ, две или више различитих ћелија се мешају и култивирају у два димензионално окружења. Кључна карактеристика овог модела је директна интеракција између различитих врста ћелија, интеракције између ћелија и ванћелијске матрице или индиректног преноса сигнала путем цитокина и хемијске комуникације. Примарне функције хепатоцита, као што су способност производње албумина и способност метаболизам дрога, могу се одржавати до три недеље.

      Апликације:

      1. 1). Примарни хепатоцити Цо - Култивисани са фибробластима: Овај модел се користи за проучавање стопе клиренса спорог - метаболизујућих једињења и њихових метаболита.
      2. 2). Примарни хепатоцити Цо - Култиверују се са нон - парехималним ћелијама јетре (нпр. Стееллатне ћелије, синусоидне ендотелне ћелије): Овај модел је користан за истраживање повреде јетре (Дили), јер помаже да се истражи улога цитокина, хемокина и фактора раста, модулације изложености на дрогу.
      3. 3). Примарни хепатоцити ЦО - Култивисани са Т ћелијама: Овај модел се користи за откривање метаболизма дрога јетре - специфичне одговоре Т ћелија.
      4. 4). Ифасе'с Хепатомак ™ЦО - Културни систем: Ифасе је развио систем за културу ЦО - са примарним хепатоцитима из различитих врста, познатих као Хепатомак™. Аутор ЦО - Култивални култивијски примарни хепатоцити са стромима ћелијама, могуће је одржавати добру активност метаболизујућих ензима у људским хепатоцитима до 3 недеље. Овај систем је погодан за студирање спорог - стопе за уклањање метаболизатора и њихових метаболита.

      Овај модел ЦО - културе пружа физиолошкију релевантну платформу за процену метаболизма лека, токсичност и јетрене процесе сродне болести, који нуде увиде у то како различити ћелијски типови доприносе функцији и болести јерине.
      
      

      3Д Примарни Хепатоците Цо - Модел културе културе

      Директно 3Д ЦО - Култура: Овај модел укључује мешање две или више различитих врста ћелија јетре (нпр., Примарне хепатоците, синусоидне ендотелне ћелије, хепатске звечне ћелије, купфферске ћелије) да би формирали само - монтиране сфероиде или ЦО - који их култивирају у 3Д окружењу изграђене са материјалима попут колагена, фибрина, алгината или хидрогела. Директно 3Д ЦО - култура омогућава блиску интеракцију између различитих ћелија јетре кроз механизме попут цијелог лепљења у цијели цијеви, паракрин сигнализацију путем растворљивих цитокина и екстраћелијских адхезија матрица, омогућавајући комуникацију између хепатоцита.

      Апликације:

      1. 1). Модел фиброзе јетре: користи се за проучавање механизама и напредовања фиброзе јетре.
      2. 2). ДРАКИ - Озљеда јетре (Дили) Модел: помаже да симулира и процени оштећење јетре узрокованих лековима.
      3. 3). Интеракције о дрогама, метаболизам дрога и индукција ензима: процењује се како различити лекови интеракције, како су метаболизирани и како индукују ензими јетре.

      Индиректна 3Д ЦО - Култура: Ова метода користи систем физичког раздвајања (нпр. Транселл или друге материјале) до културе две или више врста ћелија (као што су примарни хепатоцити са НИХ / 3Т3 ћелијама или синусоидним ендотелним ћелијама) у 3Д окружењу, где је спречено директно ћелијско контакт за - ћелију. Комуникација између ћелија настаје путем растворљивих цитокина.

      Апликације:
      Користи се за проучавање неактивне комуникације између ћелија јетре у телу.

      
      Укратко, ипхасе, као лидер у ин витро биолошко истраживање, пружа свеобухватна решења за небичко испитивање лекова. Из изолације и културе примарних хепатоцита из различитих врста на развој пратећих производа као што су медији за културу за одређене апликације или мулти - спецификације Цоллаген - пресвучене плоче, Ифасе је посвећена нудећи најбоље ин витро истраживачке алате за откривање и развој ин витро истраживачке алате и развој. Ми смо поуздан партнер за клијенте у фармацеутској индустрији, посвећен пружању резања ивица решења за небичко истраживање.