Inducerad RAT -lever S9 -fraktion: Ett metaboliskt aktiveringssystem för in vitro -genotoxicitet och mutationstester

Nyckelord: OECD 471, OECD 473, OECD 476, OECD 487, mutationstest, genotoxicitet, genetisk toxicitet, inducerad råttlever S9, AMES -test, mini ames -test, kromosomavvikelse, mikronucleus, HPRT/HGPRT -analys, TK -analys

IPhase -produkt

Introduktion

Inducerad råttlever S9är en nyckelkomponent vid bedömningen avgenetisk toxicitetKemikaliens potential, särskilt i reglerande toxikologi. Det används vanligtvis i kombination med in vitro -analyser, till exempelAMES -test ochmutationstester, för att utvärdera de mutagena egenskaperna hos föreningar. Genom att tillhandahålla enzymatiska system som är rikt på cytokrom P450 (CYP450) spelar den inducerade lever -S9 -fraktionen en avgörande roll för att simulera de metaboliska processer som förekommer i levern, vilket hjälper till att bestämma om kemikalier potentiellt kan orsaka genetiska mutationer eller cancer.

Inducerad råttlever S9

Lever S9 -fraktionen hänvisar till en post - mitokondriell supernatant erhållen från råttleverhomogenat efter en serie centrifugeringssteg. Termen "inducerad" hänvisar till behandlingen av råttor med specifika föreningar som förbättrar aktiviteten hos leverenzymer, särskilt cytokrom P450 -enzymer (CYP450), som är ansvariga för metabolismen av ett brett spektrum av xenobiotikum.

Den inducerade råttlever S9 -fraktionen innehåller en mängd enzymer som är involverade i fas I och fas II -metabolism hos kemikalier. Detta inkluderar enzymer såsom cytokrom P450 monooxygenaser, som underlättar oxidativ biotransformation av substrat och därmed efterliknar mänsklig levermetabolism.

CYP450 -aktivitet och metabolisk aktivering

Cytokrom P450 -enzymfamiljen (CYP450) spelar en viktig roll i metabolismen hos en mängd olika ämnen, inklusive många läkemedel, miljökemikalier och cancerframkallande ämnen. Den inducerade råttlever S9 -fraktionen innehåller dessa enzymer och är avgörande för att utvärdera kemikalier som bara kan bli genotoxiska efter metabolisk aktivering.

Många föreningar är initialt icke - toxiska men kan bli giftiga efter metabolism i levern. Dessa pro - mutagener (som kräver metabolisk aktivering för att bli mutagena) och pro - karcinogener (som kräver aktivering för att orsaka cancer) kan endast detekteras genom analyser som inkluderar ett S9 -metaboliskt aktiveringssystem. Utan induktion av metaboliska enzymer som CYP450 kan dessa ämnen tyckas vara ofarliga i standardgenotoxicitetstester.

Genom att lägga till inducerad Rat Liver S9 till in vitro -analyser kan forskare bedöma hur ett ämne interagerar med CYP450 -enzymerna. Detta är särskilt viktigt för läkemedel, eftersom metabolism av CYP450 -enzymer är ett kritiskt steg i farmakokinetiken för många läkemedel.

Tillämpningar av inducerad Rat Liver S9

1. 1. AMES -test (OECD 471)

AMES -testet, beskrivet i riktlinjeOECD 471, är en av de mest välkända och mest använda metoderna för att bedöma mutagenicitet. Det handlar om att exponera stammar av Salmonella -bakterier för en testkemikalie för att se om den inducerar mutationer som får bakterierna att återgå till ett histidin - Oberoende tillstånd.

För att simulera den mänskliga metaboliska processen tillsätts ofta inducerad lever -lever S9 till testsystemet. S9 -fraktionen tillhandahåller de nödvändiga enzymerna, inklusive CYP450, som kan krävas för att metabolisera föreningen till en mer reaktiv form som kan orsaka mutationer i det bakteriella DNA. Denna kombination av S9 med AMES -testet möjliggör en mer omfattande bedömning av mutagen potential genom att efterlikna både direkta och metaboliskt aktiverade mutagena mekanismer.

2. 2.Mutationstester (kromosomal avvikelse test, mikronukleus -test och andra in vitro -analyser)

Förutom AMES -testet används mutationstester ofta för att utvärdera kemikaliens genotoxiska potential. Dessa tester är mer omfattande för att bedöma en rad genetiska skador, inklusive kromosomala mutationer, genmutationer och bildning av mikronuklei. Inducerad Rat Liver S9 används i mutationstester av följande skäl:

Micronucleus Test (OECD 487)

Detta test upptäcker bildningen av mikronuklei i celler, som är små, extranukleära kroppar som innehåller fragment av kromosomer eller hela kromosomer som inte har införlivats i kärnan under celldelning. De mikronukleusprovkan upptäcka klastogena (kromosom - brytning) och aneugeniska effekter (som påverkar kromosomantal). Inducerad Råttlever S9 används här för att aktivera testämne metaboliskt, eftersom vissa kemikalier endast orsakar kromosomskador när de har metaboliserats av leverenzymer. S9 -fraktionen förbättrar testets känslighet genom att simulera den metaboliska aktiveringen som kan inträffa in vivo.

Chromosomal Aberration Test (OECD 473)

Detta test utvärderar om ett ämne kan orsaka strukturella skador på kromosomer genom att inducera pauser, borttagningar, translokationer eller andra typer av avvikelser. Som Micronucleus -testet,kromosomavvikningkan appliceras med eller utan metabolisk aktivering. Inducerad Råttlever S9 tillsätts till testsystemet för att härma de metaboliska processerna i levern, vilket möjliggör bedömning av ämnen som kanske inte orsakar kromosomskador i deras ursprungliga form men kan göra det efter levermetabolismen.

Tabell 1. Jämförande överväganden av mutationstester

HPRT/HGPRT -analys (OECD 476)

IHPRT/HGPRT -analys, kulturer av kinesisk hamster (CHO eller V79) eller human lymfoblastoid (TK6) -celler utsätts för testkemikalien i närvaro av en inducerad lever -lever -S9 -metabolisk blandning, som levererar CYP450 -enzymer som krävs för att omvandla pro -mutagener till DNA -reaktiva arter. Efter en kort behandling och en sju dagars uttrycksperiod utmanas celler med 6 -tioguanin; Endast kloner som bär förlust -av -funktionsmutationer i hypoxantin -guanin fosforibosyltransferasgen överlever. Genom att jämföra mutantkoloniräkningar med övergripande livskraft, bestämmer forskare en mutationsfrekvens som, om de reproducerbart upphöjda över både samtidiga och historiska kontroller, indikerar genotoxisk potential.

TK -analyser (OECD 490 & OECD 476)

DeTK -analys använder antingen L5178Y muslymfomceller (OECD 490) eller CHO -celler (OECD 476) konstruerad heterozygot vid tymidinkinas lokus. Efter kemisk exponering ± S9 -blandning återhämtar sig celler och pläteras i medium som innehåller trifluorotymidin, vilket dödar TK -effektiva celler. Överlevande tk⁻ -mutanter bildar kolonier under 10–14 dagar, med små kolonimutanter som ofta återspeglar kromosomala händelser och stora kolonimutanter som återspeglar punktmutationer. Liksom i HPRT/HGPRT -analysen, återspeglar stränga cytotoxicitetskontroller och positiva mutagen riktmärken att observerade ökningar i mutationsfrekvens pålitligt återspeglar en förenings genotoxiska risk.

4. 4. Cancerriskbedömning

Inducerad råttlever S9 används också i studier som syftar till att bedöma cancer - orsakar potentialen för ämnen. Genom att simulera de metaboliska processerna som förekommer i den mänskliga levern kan S9 -fraktionen hjälpa till att identifiera föreningar som kan leda till bildning av reaktiva metaboliter som kan binda till DNA och orsaka mutationer som kan leda till cancer.

Förbättrat ames -test med inducerad hamsterlever S9

Enligt de senaste riktlinjerna som utfärdats av European Medicines Agency (EMA) kanske det traditionella AMES -testet inte är tillräckligt känsligt för att upptäcka den mutagena potentialen för vissa Nitrosaminföroreningar, särskilt Nitrosodimetylamin (NDMA), bland andra. Därför har det förbättrade AMES -testet, utvecklat av National Center for Toxicological Research (NCTR), en division av U.S. Food and Drug Administration (FDA), rekommenderats som ett mer pålitligt alternativ. Det förbättrade AMES -testet introducerade tillsats av inducerad hamsterlever S9, som utfördes i innehållande 30% råttlever S9 och 30% hamsterlever S9. Rått- och hamster -desmosomala supernatanter (S9s) bör framställas från gnagare som behandlas med cytokrom P450 -enzym - inducerande ämnen. Genom att använda inducerad hamsterlever S9 simulerar detta förbättrade test bättre mänsklig metabolism och ökar resultatens tillförlitlighet.

Slutsats

Inducerad Rat Liver S9 fungerar som ett kritiskt verktyg vid genotoxicitetstestning, vilket hjälper forskare och tillsynsmyndigheter att bedöma den mutagena och cancerframkallande potentialen hos kemikalier. Genom att tillhandahålla ett metaboliskt aktiveringssystem förbättrar det förmågan hos analyser som AMES -test, mutationstester och CYP450 -aktivitetsstudier för att upptäcka ämnen som kräver metabolisk aktivering för att bli genotoxiska. Dess tillämpningar är viktiga för att säkerställa säkerheten för nya läkemedel, kemikalier och konsumentprodukter. Med sin roll i att simulera mänsklig levermetabolism fortsätter den inducerade RAT -lever S9 -fraktionen att vara en oumbärlig del av modern toxikologi och bedömningar av lagstiftningen.