Sapilitan na daga ng atay S9 na bahagi: isang metabolic activation system para sa vitro genotoxicity at mutation test

Mga keyword: OECD 471, OECD 473, OECD 476, OECD 487, Mutation Test, Genotoxicity, Genetic Toxicity, Induced Rat Liver S9, Ames Test, Mini Ames Test, Chromosomal Aberration, Micronucleus, HPRT/HGPRT Assay, TK Assay

Produkto ng iphase

Panimula

Sapilitan rat atay S9ay isang pangunahing sangkap sa pagtatasa ngToxicity ng Geneticpotensyal ng mga kemikal, lalo na sa regulasyon na toxicology. Karaniwang ginagamit ito sa pagsasama sa mga vitro assays, tulad ngPagsubok sa Ames atMga Pagsubok sa Mutation, upang masuri ang mga katangian ng mutagenic ng mga compound. Sa pamamagitan ng pagbibigay ng enzymatic system na mayaman sa cytochrome P450 (CYP450), ang sapilitan na daga ng atay S9 na bahagi ay gumaganap ng isang mahalagang papel sa pag -simulate ng mga proseso ng metabolic na nagaganap sa atay, na tumutulong upang matukoy kung ang mga kemikal ay maaaring maging sanhi ng genetic mutations o cancer.

Sapilitan rat atay S9

Ang bahagi ng atay S9 ay tumutukoy sa isang post - mitochondrial supernatant na nakuha mula sa mga homogenates ng daga ng daga pagkatapos ng isang serye ng mga hakbang sa sentripugasyon. Ang salitang "sapilitan" ay tumutukoy sa paggamot ng mga daga na may mga tiyak na compound na nagpapaganda ng aktibidad ng mga enzyme ng atay, lalo na ang mga cytochrome P450 enzymes (CYP450), na responsable para sa metabolismo ng isang malawak na hanay ng xenobiotic.

Ang sapilitan na daga ng atay S9 na bahagi ay naglalaman ng iba't ibang mga enzyme na kasangkot sa phase I at phase II metabolismo ng mga kemikal. Kasama dito ang mga enzymes tulad ng cytochrome P450 monooxygenases, na pinadali ang oxidative biotransformation ng mga substrate, sa gayon gayahin ang metabolismo ng atay ng tao.

Aktibidad ng CYP450 at pag -activate ng metabolic

Ang pamilya ng cytochrome P450 enzyme (CYP450) ay gumaganap ng isang mahalagang papel sa metabolismo ng isang iba't ibang mga sangkap, kabilang ang maraming mga parmasyutiko, kemikal sa kapaligiran, at mga carcinogens. Ang sapilitan na maliit na bahagi ng atay S9 ay naglalaman ng mga enzymes na ito at mahalaga para sa pagsusuri ng mga kemikal na maaari lamang maging genotoxic pagkatapos ng metabolic activation.

Maraming mga compound ang una ay hindi - nakakalason ngunit maaaring maging nakakalason pagkatapos ng metabolismo sa atay. Ang mga pro - mutagens (na nangangailangan ng metabolic activation upang maging mutagenic) at pro - carcinogens (na nangangailangan ng pag -activate upang maging sanhi ng cancer) ay maaari lamang makita sa pamamagitan ng mga assays na kasama ang isang S9 metabolic activation system. Kung wala ang induction ng metabolic enzymes tulad ng CYP450, ang mga sangkap na ito ay maaaring lumitaw na hindi nakakapinsala sa karaniwang mga pagsubok sa genotoxicity.

Sa pamamagitan ng pagdaragdag ng sapilitan na daga ng atay S9 sa mga vitro assays, maaaring masuri ng mga mananaliksik kung paano nakikipag -ugnay ang isang sangkap sa mga enzyme ng CYP450. Mahalaga ito lalo na para sa mga parmasyutiko, dahil ang metabolismo ng mga enzyme ng CYP450 ay isang kritikal na hakbang sa mga parmasyutiko ng maraming gamot.

Mga aplikasyon ng sapilitan na daga ng atay S9

1. 1. Pagsubok sa Ames (OECD 471)

Ang pagsubok ng Ames, na nakabalangkas sa gabayOECD 471, ay isa sa mga pinaka mahusay - kilala at malawak na ginagamit na mga pamamaraan para sa pagtatasa ng mutagenicity. Ito ay nagsasangkot ng paglalantad ng mga strain ng bakterya ng salmonella sa isang kemikal na pagsubok upang makita kung nagpapahiwatig ito ng mga mutasyon na nagiging sanhi ng bakterya na bumalik sa isang histidine - independiyenteng estado.

Upang gayahin ang proseso ng metabolic ng tao, ang sapilitan na daga ng atay S9 ay madalas na idinagdag sa sistema ng pagsubok. Ang bahagi ng S9 ay nagbibigay ng kinakailangang mga enzymes, kabilang ang CYP450, na maaaring kailanganin upang masukat ang tambalan sa isang mas reaktibo na form na maaaring maging sanhi ng mga mutasyon sa bakterya na DNA. Ang kumbinasyon ng S9 na ito sa pagsubok ng AMES ay nagbibigay -daan para sa isang mas malawak na pagtatasa ng potensyal na mutagenic sa pamamagitan ng paggaya ng parehong direkta at metabolikong aktibo na mga mekanismo ng mutagenic.

2. 2.Mga Pagsubok sa Mutation (Chromosomal Aberration Test, Micronucleus Test, at Iba pang In Vitro Assays)

Bilang karagdagan sa pagsubok ng AMES, ang mga pagsusuri sa mutation ay karaniwang ginagamit upang suriin ang genotoxic potensyal ng mga kemikal. Ang mga pagsubok na ito ay mas komprehensibo sa pagtatasa ng isang hanay ng mga pinsala sa genetic, kabilang ang mga mutasyon ng chromosomal, mutation ng gene, at ang pagbuo ng micronuclei. Ang sapilitan na daga ng atay S9 ay ginamit sa mga pagsubok sa mutation para sa mga sumusunod na kadahilanan:

Pagsubok sa Micronucleus (OECD 487)

Ang pagsubok na ito ay nakakakita ng pagbuo ng micronuclei sa mga cell, na maliit, extranuclear na katawan na naglalaman ng mga fragment ng chromosome o buong chromosome na hindi isinama sa nucleus sa panahon ng cell division. Ang Pagsubok sa Micronucleusmaaaring makita ang clastogenic (chromosome - break) at aneugenic (nakakaapekto sa chromosome number) na mga epekto. Ang sapilitan na daga ng atay S9 ay ginagamit dito upang maisaaktibo ang sangkap ng pagsubok na metaboliko, dahil ang ilang mga kemikal ay nagdudulot lamang ng pinsala sa chromosomal sa sandaling na -metabolize sila ng mga enzyme ng atay. Ang maliit na bahagi ng S9 ay nagpapabuti sa pagiging sensitibo ng pagsubok sa pamamagitan ng pag -simulate ng metabolic activation na maaaring mangyari sa vivo.

Chromosomal Aberration Test (OECD 473)

Sinusuri ng pagsubok na ito kung ang isang sangkap ay maaaring maging sanhi ng pinsala sa istruktura sa mga kromosom sa pamamagitan ng pag -uudyok ng mga break, pagtanggal, pagsasalin, o iba pang mga uri ng mga pag -aberrasyon. Tulad ng pagsubok sa micronucleus, angChromosomal aberration testmaaaring mailapat sa o walang metabolic activation. Ang sapilitan na daga ng atay S9 ay idinagdag sa sistema ng pagsubok upang gayahin ang mga proseso ng metabolic sa atay, na pinapayagan ang pagtatasa ng mga sangkap na maaaring hindi maging sanhi ng pagkasira ng chromosomal sa kanilang orihinal na anyo ngunit maaaring gawin ito pagkatapos ng metabolismo ng atay.

Talahanayan 1. Paghahambing na pagsasaalang -alang ng mga pagsubok sa mutation

Hprt/hgprt assay (OECD 476)

SaHPRT/HGPRT ASSAY. Matapos ang isang maikling paggamot at isang pitong araw na expression na panahon, ang mga cell ay hinamon ng 6 - thioguanine; Tanging ang mga clones na nagdadala ng pagkawala - ng - function mutations sa hypoxanthine - guanine phosphoribosyltransferase gene ay nabubuhay. Sa pamamagitan ng paghahambing ng mga bilang ng kolonya ng mutant sa pangkalahatang kakayahang umangkop, tinutukoy ng mga mananaliksik ang isang dalas ng mutation na, kung muling nakataas ang nakataas sa parehong mga magkakasabay at makasaysayang kontrol, ay nagpapahiwatig ng potensyal na genotoxic.

TK Assays (OECD 490 & OECD 476)

AngTK assay gumagamit ng alinman sa L5178Y mouse lymphoma cells (OECD 490) o CHO cells (OECD 476) inhinyero heterozygous sa thymidine kinase locus. Kasunod ng pagkakalantad ng kemikal ± S9 mix, ang mga cell ay gumaling at naka -plate sa daluyan na naglalaman ng trifluorothymidine, na pumapatay sa mga cell na may sapat na TK. Ang nakaligtas na mga mutant ng TK⁻ ay bumubuo ng mga kolonya sa paglipas ng 10-14 araw, na may maliit na mga mutant na kolonya ay madalas na sumasalamin sa mga kaganapan sa chromosomal at malalaking colony mutants na sumasalamin sa mga mutation ng point. Tulad ng sa HPRT/HGPRT assay, ang mahigpit na mga kontrol sa cytotoxicity at positibong benchmark ng mutagen ay tinitiyak na ang mga sinusunod na pagtaas sa dalas ng mutation ay maaasahan na sumasalamin sa panganib ng genotoxic ng compound.

4. 4. Pagtatasa sa Panganib sa Kanser

Ang sapilitan na daga ng atay S9 ay ginagamit din sa mga pag -aaral na naglalayong masuri ang cancer - na nagdudulot ng potensyal ng mga sangkap. Sa pamamagitan ng pag -simulate ng mga proseso ng metabolic na nagaganap sa atay ng tao, ang maliit na bahagi ng S9 ay makakatulong na makilala ang mga compound na maaaring humantong sa pagbuo ng mga reaktibo na metabolite na may kakayahang magbubuklod sa DNA at magdulot ng mga mutasyon na maaaring humantong sa kanser.

Pinahusay na pagsubok ng Ames na may sapilitan na hamster atay S9

Ayon sa pinakabagong mga alituntunin na inisyu ng European Medicines Agency (EMA), ang tradisyunal na pagsubok ng AMES ay maaaring hindi sapat na sensitibo upang makita ang potensyal na mutagenic ng ilang mga n - nitrosamine impurities, lalo na n - nitrosodimethylamine (NDMA), bukod sa iba pa. Samakatuwid, ang pinahusay na pagsubok ng AMES, na binuo ng National Center for Toxicological Research (NCTR), isang dibisyon ng U.S. Food and Drug Administration (FDA), ay inirerekomenda bilang isang mas maaasahang alternatibo. Ang pinahusay na pagsubok ng AMES ay ipinakilala ang pagdaragdag ng sapilitan na hamster atay S9, na gumanap sa naglalaman ng 30% na daga ng atay S9 at 30% hamster atay S9. Ang mga rat at hamster desmosomal supernatants (S9s) ay dapat ihanda mula sa mga rodent livers na ginagamot sa cytochrome P450 enzyme - nakakaakit na mga sangkap. Sa pamamagitan ng paggamit ng sapilitan na hamster atay S9, ang pinahusay na pagsubok na ito ay mas mahusay na ginagaya ang metabolismo ng tao at pinatataas ang pagiging maaasahan ng mga resulta.

Konklusyon

Ang sapilitan na daga ng atay S9 ay nagsisilbing isang kritikal na tool sa pagsubok sa genotoxicity, na tumutulong sa mga mananaliksik at mga ahensya ng regulasyon na masuri ang mutagenic at carcinogenic potensyal ng mga kemikal. Sa pamamagitan ng pagbibigay ng isang metabolic system ng pag -activate, pinapahusay nito ang kakayahan ng mga assays tulad ng pagsubok ng AMES, mga pagsubok sa mutation, at pag -aaral ng aktibidad ng CYP450 upang makita ang mga sangkap na nangangailangan ng metabolic activation upang maging genotoxic. Mahalaga ang mga aplikasyon nito para matiyak ang kaligtasan ng mga bagong gamot, kemikal, at mga produktong consumer. Sa papel nito sa pag -simulate ng metabolismo ng atay ng tao, ang sapilitan na daga ng atay S9 na bahagi ay patuloy na isang kailangang -kailangan na bahagi ng modernong toxicology at mga pagtatasa sa kaligtasan ng regulasyon.