Pangunahing hepatocytes: Isang mahalagang tool para sa pagsulong ng Non - Clinical In Vitro Drug Research

Pangunahing hepatocytes: Isang mahalagang tool para sa pagsulong ng Non - Clinical In Vitro Drug Research

Ang atay, bilang pangunahing organ para sa pagkakalantad ng droga, ay gumaganap ng isang mahalagang papel sa mga proseso ng metabolismo ng gamot at pagkakalason. Ang mga pangunahing hepatocytes ay nagtataglay ng buong spectrum ng mga cellular na katangian at mga antas ng physiological ng mga enzymes at cofactors, kabilang ang lamad - nakatali na mga enzyme tulad ng cytochrome P450 (isang halo -halong - function oxidase sa makinis na endoplasmic reticulum) at cytosolic esterases, na sumasaklaw sa lahat ng mga metabolic pathway na matatagpuan sa liver. Para sa kadahilanang ito, ang mga pangunahing hepatocytes ay malawak na itinuturing na pamantayang ginto para sa pagtatayo ng mga modelo ng vitro atay at pinapaboran ng mga mananaliksik sa pakikipag -ugnay sa droga, metabolismo ng droga, at pag -aaral ng toxicity. Ang artikulong ito ay nagbibigay ng isang pangkalahatang -ideya ng mga modelo ng kultura ng 2D at 3D batay sa mga pangunahing hepatocytes at ang kanilang mga aplikasyon sa pag -unlad ng droga.

Mga keyword: Pangunahing hepatocytes, 2d Cultivation, 3d Cultivation, Organoids, Co - Kultura.

1. 1. Ang paghihiwalay ng mga pangunahing hepatocytes

Ang paghihiwalay ng mga pangunahing hepatocytes ay isang kritikal na hakbang sa pagtatatag ng mga modelo ng vitro atay, kasama ang dalawang - step collagenase perfusion na paraan na ang pinaka -karaniwang ginagamit. Sa mas maliit na mga hayop, ang perfusion ng atay ay maaaring isagawa sa pamamagitan ng portal vein o mas mababang vena cava, habang ang mas malalaking hayop ay karaniwang nangangailangan ng pabango sa pamamagitan ng mga lobes o mga segment. Maraming mga pangunahing kadahilanan ang nakakaimpluwensya sa matagumpay na paghihiwalay ng mga hepatocytes: Una, ang collagenase ay dapat na hindi - cytotoxic. Pangalawa, ang tiyempo ng panunaw ay mahalaga -Parehong sa ilalim ng - panunaw at higit sa - ang panunaw ay maaaring makompromiso ang ani ng hepatocyte at kakayahang umangkop. Pangatlo, ang kondisyon ng atay ay dapat na pinakamainam, dahil ang mga hepatocytes ay lubos na sensitibo sa pagkasira ng ischemic. Ang atay na ginamit para sa paghahanda ng hepatocyte ay dapat na mabilis na pinalamig upang mabawasan ang mga rate ng metabolic at maiwasan ang metabolic hypoxia at kasunod na ischemia.

Ang mga pamantayan para sa mga pangunahing hepatocytes na ginamit sa pananaliksik sa droga ay ang mga sumusunod:

1. 2. Pangunahing Kultura ng Hepatocyte 2D

Ang suspensyon na hepatocyte model

Naglalaman ito ng kumpletong gamot - metabolizing enzymes at cofactors, na ginagawang angkop para sa pag -aaral ng iba't ibang mga landas ng metabolic clearance. Gayunpaman, ang kakayahang umangkop ng mga hepatocytes ng suspensyon at ang aktibidad ng gamot - Ang pag -metabolize ng mga enzyme ay unti -unting bumababa habang tumataas ang oras ng incubation ng vitro, na nililimitahan ang oras ng pagpapapisa ng itlog sa isang maximum na 4 na oras. Ang modelong ito ay karaniwang ginagamit upang matantya ang clearance ng mga gamot na may katamtaman hanggang sa mataas na rate ng clearance. Kapag ang rate ng clearance ay mas mababa sa 20%, ang tumpak na mga halaga ng clearance ay hindi matukoy. Ang tradisyunal na suspensyon na hepatocyte - batay sa mga modelo ng vitro metabolismo ay hindi sapat para sa pagbuo ng mga nakikitang metabolic reaksyon para sa mabagal - metabolizing compound, kaya nililimitahan ang kanilang kakayahang mahulaan ang mga rate ng clearance at metabolic na mga produkto ng mga compound na ito. Ang isang suspensyon na hepatocyte relay na pamamaraan (Larawan 1) ay maaaring magamit upang mapalawak ang oras ng pagpapapisa ng itlog sa 20 oras o mas mahaba.

Application:Aktibidad ng enzyme at pag -aaral ng katatagan ng metabolic para sa mga maliliit na gamot na molekula.

Larawan 1. Suspension Hepatocyte Relay Paraan ng Paglilipat ng Paraan

Pinagmulan: Drug Metab Dispos, 2012,40 (9): 1860–1865

Ang plateable hepatocytes model

Ang mga pangunahing hepatocytes ay naka -kultura sa isang 2D system sa collagen - pinahiran na mga plato ng kultura. Ang mga hepatocytes ay nagpapakita ng isang epithelial morphology, na may nakausli na nuclei, na madalas na nagtatanghal sa isang binucleated form. Ang mga drawback ng solong hepatocyte monolayer culture ay kinabibilangan ng: 1. Pagbabago ng cell polarity at function.2. Kakulangan ng iba pang mga nauugnay na uri ng cell (i.e., hindi - parenchymal cells) na kinakailangan para sa normal na pag -andar.3. Kawalan ng kakayahang magbigay ng sapat na mga nutrisyon at paracrine factor upang suportahan ang mga hepatocytes sa pagsasagawa ng kanilang mga pag -andar (tulad ng bile acid at serum protein biosynthesis).

Mga Aplikasyon:

1). Pagsusuri ng Gamot - Pakikipag -ugnay sa Gamot:Kasama dito ang enzyme induction, enzyme inhibition, at transporter studies. Una, kapag ang isang gamot ay kumikilos bilang isang inducer, maaari itong humantong sa pagtaas ng pagpapahayag ng gamot - metabolizing enzymes at transporter. Ang mga malakas na inducer ay maaaring magregulat ng maraming mga gene nang sabay -sabay, tulad ng phenobarbital induction ng CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9, UGT, at ilang mga protina ng transportasyon tulad ng MRP2. Pangalawa, may mga species - tiyak na pagkakaiba sa kung paano tumugon ang mga hepatocytes sa mga inducer. Halimbawa, ang rifampicin ay isang epektibong inducer para sa mga tao at kuneho hepatocytes, ngunit walang epekto sa induction sa mga hepatocytes ng daga. Sa wakas, ang suboptimal plating density ng mga plateable hepatocytes ay maaaring humantong sa nabawasan na basal expression ng P450s at artipisyal na pagtaas ng mga tugon sa induction. Tulad ng ipinapakita sa Figure 3, ang mga hepatocytes sa mas mababang mga density ng kalupkop ay nagpapakita ng mas mababang aktibidad na basal ng CYP1A2, CYP2B6, at CYP3A4, ngunit mas malakas na mga tugon sa induction. Samakatuwid, ang malusog na hepatocytes sa isang naaangkop na density ng kalupkop ay kinakailangan upang makakuha ng data na may kaugnayan sa physiologically.

Larawan 2. Pakikipag -ugnayan sa pagitan ng kalupkop na density ng cryopreserved na mga hepatocytes ng tao at induction ng enzyme

Pinagmulan: Kasalukuyang Mga Teknolohiya sa Pagtuklas ng Gamot, 2010, 7: 188 - 198

2). Pagtatasa ng Hepatotoxicity: Ang pag -obserba ng mga pagbabago sa morphological sa ilalim ng isang light mikroskopyo, tulad ng cell morphology, vacuole at lipid droplet na pagsasama -sama, at pagkakabit ng cell/detatsment. Ang pagtuklas ng hepatocyte nekrosis (tulad ng ipinahiwatig ng aspartate aminotransferase, lactate dehydrogenase, at alanine aminotransferase) at apoptosis (fragmentation ng DNA). Para sa cytokine - mediated cytotoxicity, ang mga solong monolayer na kultura ng mga hepatocytes ay hindi maaaring mahulaan ang mga nakakalason na tugon dahil sa regulasyon ng mga sangkap na pinakawalan mula sa mga kalapit na non - parenchymal cells, tulad ng mga cell ng kupffer, stellate cells, at sinusoidal endothelial cells.

3). "Paraan ng Relay" para sa pag -aaral ng mabagal na metabolizing compound clearance at mga metabolite nito: Ang aktibidad ng gamot - Ang pag -metabolize ng mga enzyme sa mga plateable hepatocytes ay nagsisimulang bumaba pagkatapos ng 24 na oras ng kalupkop. Matapos ang pagpapapisa ng mga plato na hepatocytes na may suwero - libreng daluyan na naglalaman ng tambalan ng interes sa loob ng 24 na oras, ang daluyan ay nakolekta at halo -halong, pagkatapos ay ilipat sa mga bagong plato na hepatocytes para sa karagdagang pag -aaral (Larawan 3).

Larawan 3. Pleatable Hepatocyte Relay Paraan ng Paglilipat ng Paraan

Pinagmulan: Mga Sulat ng Metabolismo ng Gamot, 2016, 10: 3 - 15

3). Suriin ang cellular uptake, endocytosis, endosomal escape, at silencing effects sa target gene ng hepatocyte - naka -target na maliit na gamot na nucleic acid.

Modelo ng paglilinang ng sandwich

Sa vitro, ang mga hepatocytes ay maaaring mai -kultura sa pagitan ng dalawang layer ng collagen o matrigel upang muling mabuo sa mga istruktura ng vivo, na kilala bilang paglilinang ng sandwich. Ang mga hepatocytes na naka -kultura sa pagitan ng dalawang layer ng gel - collagen (istraktura ng sandwich) ay maaaring mapabuti ang morpolohiya at kakayahang umangkop ng mga cell, at mapanatili ang kanilang pag -andar sa mas mahabang panahon. Bukod dito, ang mga hepatocytes sa kultura ng sandwich ay maaaring maibalik ang polarity, na nagpapahintulot sa wastong lokalisasyon ng mga basolateral at canalicular transporters, pati na rin ang pagbuo ng mga functional bile duct network (Larawan 4).

Larawan 4. Polarized expression ng mga transporter sa Human Hepatocyte Sandwich Model

Pinagmulan: Kasalukuyang Mga Teknolohiya sa Pagtuklas ng Gamot, 2010, 7, 188 - 198

Mga Aplikasyon:

1. 1). Pagtantya ng biliary excretion ng mga compound.
2. 2). Sinusuri ang hepatic at biliary na pamamahagi ng mga endogenous at exogenous compound at metabolites.
3. 3). Pagtantya ng clearance na pinagsama ng metabolismo at mga transporter, at pagtatayo ng pisyolohiya - batay sa mga modelo ng pharmacokinetic.
4. 4). Pag -aaral ng hepatotoxicity at pagbibigay ng mga mekanismo para sa klinikal na gamot - sapilitan pinsala sa atay. Ang data ay isinama sa mga modelo ng mga modelo ng parmasyutiko upang mahulaan ang mga potensyal na gamot - sapilitan pinsala sa atay sa mga tao.
5.  
   1. 3. Pangunahing kultura ng hepatocyte 3D

6. Sa mga sistema ng kultura ng 3D, ang mga hepatocytes ay naka -kultura sa isang tatlong - dimensional na matrix, na mas mahusay na gayahin ang arkitektura ng atay ng atay kumpara sa mga kulturang 2D monolayer. Ang mga sistemang ito ay nagtataguyod ng cell - cell at cell - mga pakikipag -ugnay sa matrix, na maaaring maibalik ang higit pa sa mga pagpapaandar ng physiological ng atay, kabilang ang metabolismo ng droga, pagtatago ng protina, at pagbuo ng apdo. Ang mga pangunahing kultura ng hepatocyte 3D ay maaaring magamit upang pag -aralan ang atay - Mga tiyak na pag -andar sa isang higit pa sa vivo - tulad ng kapaligiran, na nag -aalok ng mga pakinabang para sa pagsubok sa droga, pagtatasa ng toxicity, at pagmomolde ng sakit.

   Modelong Spheroid

Sa pamamagitan ng mga pamamaraan tulad ng ultra - mababang kultura ng kalakip, nakabitin na drop culture, at magnetic cell culture (Larawan 5), ang mga pangunahing hepatocytes ay maaaring magkasama sa spheroidal aggregates na may diameter ng hanggang sa 150 - 175 µm nang hindi umaasa sa mga panlabas na matrices. Ang isang bentahe ng kultura ng spheroid ay ang bawat spheroid ay nangangailangan lamang ng 1,330 - 2,000 mga cell, na makabuluhang binabawasan ang bilang ng mga cell kumpara sa iba pang mga diskarte sa kultura ng 3D. Ang mga kamakailang pag -aaral ay nagpakita na ang mga pangunahing kultura ng spheroid ng hepatocyte ay maaaring mapanatili ang hanggang sa 5 linggo, na may aktibidad na CYP enzyme na nananatiling halos hindi nagbabago sa pagitan ng araw 8 at araw 35. Ang pagsusuri ng proteomics ay nagsiwalat na, kumpara sa kultura ng sandwich, ang mga enzyme na responsable para sa pagsipsip ng droga, pamamahagi, metabolismo, at ang pag -excret ay mas mahusay na mapangalagaan para sa 14 na araw sa kultura ng spheroid. Gayunpaman, ang atay ay mas kumplikado kaysa sa isang pinagsama -samang cell. Ang basolateral na bahagi ng hepatocytes ay nakikipag -ugnay sa dugo, habang ang apdo ay dumadaloy mula sa apical side, na kung saan ay isang pangunahing tampok ng kumplikadong istraktura ng lobule ng atay, at hindi pa ito maaaring mai -replicate sa modelo ng spheroid.

Mga Aplikasyon:

1. 1). Pag -aaral ng mabagal na metabolizing compound clearance at mga metabolite nito.
2. 2). Pananaliksik ng Hepatotoxicity.
3. 3). Ang pagsusuri ng cellular uptake, endocytosis, endosomal escape, at silencing effects sa mga target na gene ng hepatocyte - naka -target na maliit na nucleic acid na gamot.

Larawan 5. Paraan ng kultura ng Spheroid

Modelong Organids ng Liver

Ang kahulugan ng pinagkasunduan ng mga organoid ay: Ang mga istruktura ng 3D na nagmula sa mga stem cell, mga cell ng progenitor, o mga magkakaibang mga cell, na may kakayahang magparami ng ilang mga pag -andar at istruktura ng katutubong tisyu sa vitro, na epektibong gayahin ang mga vivo microen environment at cell - hanggang - mga pakikipag -ugnay sa cell. Ang mga organoid ng atay ay nakilala bilang pinaka advanced na modelo para sa pananaliksik sa biology ng atay ng tao.

Mga mapagkukunan ng cell para sa konstruksiyon ng organoid ng atay:

① Pluripotent stem cells (PSC):

Ang mga embryonic stem cells (ESC) at sapilitan pluripotent stem cells (IPSC) ay nagtataglay ng mataas na pluripotency, plasticity, at walang limitasyong kapasidad ng proliferative. Sa ilalim ng impluwensya ng mga tiyak na kadahilanan ng pag -sign, naiiba sila sa hepatocyte - tulad ng mga cell na may aktibidad at pag -andar. Gayunpaman, ang mga organoid ng atay na nagmula sa mga PSC ay maaaring sumailalim sa mga pagbabago sa epigenetic at genetic, na nagpapakita ng mga pagbabago sa chromosomal aneuploidy sa panahon ng pagpapalakas.

Mga Aplikasyon:

1. 1). Mga modelo ng sakit sa atay ng genetic
2. 2). Nakakahawang mga modelo ng sakit sa atay
3. 3). Pagsubok sa Cytotoxicity ng Gamot

② Liver tissue - nagmula sa mga cell: kabilang dito ang mga cholangiocytes at hepatocytes. Ang mga mature na hepatocytes ay nagpapanatili ng potensyal na stem cell at proliferative na kakayahan sa mga tiyak na kapaligiran. Kumpara sa PSC - nagmula ng mga organoid, ang mga organoid na nagmula sa pangunahing tisyu ay mas matanda, na may mas matatag na mga genom, at mapanatili ang katatagan ng phenotypic at genetic sa panahon ng mahabang - term sa vitro culture. Gayunpaman, ang mahabang - term na proliferative na kapasidad ng mga mature na hepatocyte organoid ay limitado kumpara sa mga pangsanggol na hepatocytes o pang -adultong mouse pangunahing hepatocytes. Ang pag -kultura ng mga hepatocyte organoids ay nananatiling mahirap.

Pamamaraan ng Kultura (Larawan 6): Ang tisyu ng atay ay hinuhukay sa mga solong cell, at ang isang halo ng matrigel at mga cell ay binhi sa isang 24 - Well plate upang mabuo ang mga istruktura na hugis - Incubate sa isang cell culture incubator (37 ° C) sa loob ng 15 minuto. Pagkatapos ng solidification, magdagdag ng tukoy na medium medium. Passage pagkatapos ng humigit -kumulang na 14 araw. Palitan ang orihinal na daluyan ng daluyan ng pagkita ng kaibhan pagkatapos ng 7 - 10 araw.

Mga Aplikasyon:

1. 1). Mga modelo ng Hepatotoxicity
2. 2). Sa Vitro Metabolism Disorder Studies
3. 3). Hindi - alkohol na mataba na sakit sa atay
4. 4). Pag -unlad ng droga para sa benign at malignant na sakit sa atay

Larawan 6. Proseso ng Kultura at Passage ng Tissue - nagmula sa mga organoid ng atay

Pinagmulan: Cell & Bioscience (2023) 13: 197

Paghahambing ng kultura ng spheroid at kultura ng organoid

4. Pangunahing Hepatocyte Co - Modelong Kultura

1. 1. 2d Pangunahing Hepatocyte Co - Modelong Kultura
      

      Sa 2D pangunahing hepatocyte Co - Culture Model, dalawa o higit pang iba't ibang mga uri ng cell ay halo -halong at kultura sa isang dalawang - dimensional na kapaligiran. Ang pangunahing tampok ng modelong ito ay ang direktang pakikipag -ugnayan sa pagitan ng iba't ibang mga uri ng cell, ang pakikipag -ugnayan sa pagitan ng mga cell at ang extracellular matrix, o ang hindi direktang paghahatid ng signal sa pamamagitan ng mga cytokine at mga komunikasyon sa kemikal. Ang mga pangunahing pag -andar ng hepatocyte, tulad ng paggawa ng albumin at kakayahan ng metabolismo ng droga, ay maaaring mapanatili hanggang sa tatlong linggo.

      Mga Aplikasyon:

      1. 1). Pangunahing hepatocytes co - kultura na may fibroblast: ang modelong ito ay ginagamit para sa pag -aaral ng rate ng clearance ng mabagal - metabolizing compound at ang kanilang mga metabolite.
      2. 2). Pangunahing hepatocytes CO - Cultured na may Non - parenchymal atay cells (hal.
      3. 3). Pangunahing hepatocytes CO - Cultured na may mga T cells: Ang modelong ito ay ginagamit upang makita ang metabolismo ng gamot sa atay - Tukoy na mga tugon sa T cell.
      4. 4). Ang Hepatomax ™ ng iPhaseCO - Culture System: Ang iPhase ay nakabuo ng isang co - culture system na may pangunahing hepatocytes mula sa iba't ibang mga species, na kilala bilang hepatomax™. Sa pamamagitan ng CO - Culturing Human Primary Hepatocytes na may mga stromal cells, posible na mapanatili ang mahusay na gamot - Ang pagsukat ng aktibidad ng enzyme sa mga hepatocytes ng tao hanggang sa 3 linggo. Ang sistemang ito ay angkop para sa pag -aaral ng mabagal - Ang mga rate ng clearance ng compound ng metabolize at ang kanilang mga metabolite.

      Ang modelong Co - kultura na ito ay nagbibigay ng isang mas may kaugnayan na platform na may kaugnayan sa physiologically para sa pagtatasa ng metabolismo ng droga, pagkakalason, at mga proseso ng sakit na may kaugnayan sa atay, na nag -aalok ng mga pananaw sa kung paano ang iba't ibang mga uri ng cell ay nag -aambag sa pag -andar ng atay at sakit.
      
      

      3d Pangunahing Hepatocyte Co - Modelong Kultura

      Direktang 3d Co - Kultura: Ang modelong ito ay nagsasangkot ng paghahalo ng dalawa o higit pang iba't ibang mga uri ng mga selula ng atay (hal., Pangunahing hepatocytes, sinusoidal endothelial cells, hepatic stellate cells, kupffer cells) upang mabuo ang sarili - nagtipon ng spheroids o co - kultura ng mga ito sa isang 3D na kapaligiran na itinayo ng mga materyales tulad ng collagen, fibrin, alginain, o hydrogels. Ang direktang 3d co - kultura ay nagbibigay -daan sa malapit na pakikipag -ugnayan sa pagitan ng iba't ibang mga selula ng atay sa pamamagitan ng mga mekanismo tulad ng cell - hanggang - pagdikit ng cell, pag -sign paracrine sa pamamagitan ng natutunaw na mga cytokine, at extracellular matrix adhesion, pagpapagana ng komunikasyon sa pagitan ng mga hepatocytes.

      Mga Aplikasyon:

      1. 1). Modelong Fibrosis ng Liver: Ginamit upang pag -aralan ang mga mekanismo at pag -unlad ng fibrosis ng atay.
      2. 2). Gamot - Modelong Incepted Liver Injury (DILI): Tumutulong na gayahin at masuri ang pinsala sa atay na dulot ng mga gamot.
      3. 3). Mga Pakikipag -ugnay sa Gamot, Metabolismo ng Gamot, at Induction ng Enzyme: Sinusuri kung paano nakikipag -ugnay ang iba't ibang mga gamot, kung paano sila nasukat, at kung paano nila pinipilit ang mga enzyme ng atay.

      Hindi tuwirang 3d co - kultura: Ang pamamaraang ito ay gumagamit ng isang pisikal na sistema ng paghihiwalay (hal., Transwell o iba pang mga materyales) sa kultura ng dalawa o higit pang mga uri ng mga cell (tulad ng mga pangunahing hepatocytes na may mga cell ng NIH/3T3 o sinusoidal endothelial cells) sa isang 3D na kapaligiran, kung saan ang direktang cell - hanggang - cell contact ay mapigilan. Ang komunikasyon sa pagitan ng mga cell ay nangyayari sa pamamagitan ng natutunaw na mga cytokine.

      Mga Aplikasyon:
      Ginamit para sa pag -aaral ng hindi - pakikipag -ugnay sa komunikasyon sa pagitan ng mga cell ng atay sa katawan.

      
      Sa buod, ang iPhase, bilang pinuno sa vitro biological research, ay nagbibigay ng komprehensibong solusyon para sa hindi pagsusuri sa klinikal na gamot. Mula sa paghihiwalay at kultura ng mga pangunahing hepatocytes mula sa iba't ibang mga species hanggang sa pagbuo ng mga sumusuporta sa mga produkto tulad ng media media para sa mga tiyak na aplikasyon o multi - pagtutukoy ng collagen - pinahiran na mga plato, ang iPhase ay nakatuon sa pag -aalok ng pinakamahusay na mga tool sa pananaliksik sa vitro para sa pagtuklas ng droga at pag -unlad. Kami ay isang pinagkakatiwalaang kasosyo para sa mga kliyente sa industriya ng parmasyutiko, na nakatuon sa pagbibigay ng pagputol - mga solusyon sa gilid para sa hindi - klinikal na pananaliksik.