İndüklenen sıçan karaciğer S9 fraksiyonu: in vitro genotoksisite ve mutasyon testleri için metabolik bir aktivasyon sistemi

Anahtar Kelimeler: OECD 471, OECD 473, OECD 476, OECD 487, mutasyon testi, genotoksisite, genetik toksisite, indüklenmiş sıçan karaciğer S9, Ames testi, mini ames testi, kromozomal sapma, mikronükleus, HPRT/HGPRT deney, tk testi

Iphase Ürünü

giriiş

İndüklenen sıçan karaciğeri S9değerlendirmede önemli bir bileşendirgenetik toksisiteÖzellikle düzenleyici toksikolojide kimyasalların potansiyeli. Yaygın olarak, in vitro analizlerle birlikte kullanılır, örneğinAmes Testi Vemutasyon testleri, bileşiklerin mutajenik özelliklerini değerlendirmek. Sitokrom P450 (CYP450) açısından zengin enzimatik sistem sağlayarak, indüklenen sıçan karaciğeri S9 fraksiyonu, karaciğerde meydana gelen metabolik süreçlerin simülasyonunda önemli bir rol oynar ve kimyasalların potansiyel olarak genetik mutasyonlara veya kansere neden olabileceğini belirlemeye yardımcı olur.

İndüklenen sıçan karaciğeri S9

Karaciğer S9 fraksiyonu, bir dizi santrifüj aşamasından sonra sıçan karaciğer homojenatlarından elde edilen bir post - mitokondriyal süpernatan anlamına gelir. "İndüklenen" terimi, çok çeşitli ksenobiyotiklerin metabolizmasından sorumlu olan karaciğer enzimlerinin, özellikle sitokrom P450 enzimlerinin (CYP450) aktivitesini arttıran spesifik bileşiklere sahip sıçanların tedavisini ifade eder.

İndüklenen sıçan karaciğeri S9 fraksiyonu, Faz I ve kimyasalların faz II metabolizmasında rol oynayan çeşitli enzimler içerir. Bu, substratların oksidatif biyotransformasyonunu kolaylaştıran, böylece insan karaciğer metabolizmasını taklit eden sitokrom P450 monooksijenazlar gibi enzimleri içerir.

CYP450 aktivitesi ve metabolik aktivasyon

Sitokrom P450 enzim ailesi (CYP450), birçok farmasötik, çevresel kimyasallar ve kanserojenler de dahil olmak üzere çok çeşitli maddelerin metabolizmasında çok önemli bir rol oynar. İndüklenen sıçan karaciğeri S9 fraksiyonu bu enzimleri içerir ve sadece metabolik aktivasyondan sonra genotoksik hale gelebilecek kimyasalları değerlendirmek için gereklidir.

Birçok bileşik başlangıçta - toksik değildir, ancak karaciğerdeki metabolizmadan sonra toksik hale gelebilir. Bu pro - mutajenler (metajenik olmak için metabolik aktivasyon gerektiren) ve Pro - kanserojenler (kansere neden olmak için aktivasyon gerektiren) sadece bir S9 metabolik aktivasyon sistemi içeren analizlerle tespit edilebilir. CYP450 gibi metabolik enzimlerin indüksiyonu olmadan, bu maddeler standart genotoksisite testlerinde zararsız görünebilir.

Araştırmacılar in vitro tahlillere indüklenen sıçan karaciğeri S9 ekleyerek, bir maddenin CYP450 enzimleriyle nasıl etkileşime girdiğini değerlendirebilirler. Bu özellikle farmasötikler için önemlidir, çünkü CYP450 enzimlerinin metabolizması birçok ilacın farmakokinetiğinde kritik bir adımdır.

İndüklenen Sıçan Karaciğer S9 uygulamaları

1. 1. Ames testi (OECD 471)

Kılavuzda özetlenen Ames testiOECD 471, mutajenisiteyi değerlendirmek için en iyi bilinen ve yaygın olarak kullanılan yöntemlerden biridir. Bakterilerin histidin - bağımsız bir duruma geri dönmesine neden olan mutasyonları indükleyip indüklemediğini görmek için Salmonella bakterilerinin suşlarını bir test kimyasalına maruz bırakmayı içerir.

İnsan metabolik sürecini simüle etmek için, indüklenen sıçan karaciğeri S9 genellikle test sistemine eklenir. S9 fraksiyonu, bileşiği bakteriyel DNA'da mutasyonlara neden olabilecek daha reaktif bir forma metabolize etmek için gerekli olabilecek CYP450 de dahil olmak üzere gerekli enzimleri sağlar. S9'un Ames testi ile bu kombinasyonu, hem doğrudan hem de metabolik olarak aktifleştirilmiş mutajenik mekanizmaları taklit ederek mutajenik potansiyelin daha kapsamlı bir değerlendirmesini sağlar.

2. 2.Mutasyon testleri (kromozomal sapma testi, mikronükleus testi ve diğer in vitro analizler)

Ames testine ek olarak, mutasyon testleri kimyasalların genotoksik potansiyelini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. Bu testler, kromozomal mutasyonlar, gen mutasyonları ve mikronüklei oluşumu dahil olmak üzere bir dizi genetik hasarın değerlendirilmesinde daha kapsamlıdır. İndüklenen sıçan karaciğeri S9, aşağıdaki nedenlerle mutasyon testlerinde kullanılır:

Mikronükleus testi (OECD 487)

Bu test, hücrelerde mikronüklei oluşumunu tespit eder, bu da hücre bölünmesi sırasında çekirdeğe dahil edilmemiş kromozom parçaları veya tüm kromozomlar içeren ekstranükleer cisimler. . mikronükleus testiklastojenik (kromozom - kırılma) ve aneujenik (kromozom sayısını etkileyen) etkileri saptayabilir. İndüklenen sıçan karaciğeri S9, test maddesini metabolik olarak aktive etmek için kullanılır, çünkü bazı kimyasallar sadece karaciğer enzimleri tarafından metabolize edildikten sonra kromozomal hasara neden olur. S9 fraksiyonu, in vivo meydana gelebilecek metabolik aktivasyonu simüle ederek testin hassasiyetini arttırır.

Kromozomal sapma testi (OECD 473)

Bu test, bir maddenin kırılmaları, silinmeleri, translokasyonları veya diğer sapma türlerini indükleyerek kromozomlarda yapısal hasara neden olup olmadığını değerlendirir. Mikronükleus testi gibi,kromozomal sapma testimetabolik aktivasyon ile veya metabolik aktivasyon olmadan uygulanabilir. İndüklenen sıçan karaciğeri S9, karaciğerdeki metabolik süreçleri taklit etmek için test sistemine eklenir ve orijinal formlarında kromozomal hasara neden olmayabilecek, ancak karaciğer metabolizmasından sonra bunu yapabilecek maddelerin değerlendirilmesine izin verir.

Tablo 1. Mutasyon testlerinin karşılaştırmalı hususları

HPRT/HGPRT Deneyi (OECD 476)

İçindeHPRT/HGPRT deneyi, Pro - mutagenleri DNA -reaktif türlere dönüştürmek için gereken CYP450 enzimlerini tedarik eden CYP450 enzimlerini tedarik eden indüklenmiş bir sıçan karaciğeri S9 metabolik karışımının varlığında, Çin hamster (Cho veya V79) veya insan lenfoblastoid (TK6) hücrelerinin kültürleri, test kimyasalına maruz kalır. Kısa bir tedavi ve yedi günlük bir ekspresyon döneminden sonra hücreler 6 - tiyoguanin ile meydan okunur; Sadece hipoksantin - guanin fosforibosiltransferaz genindeki fonksiyon mutasyonlarının kaybını taşıyan klonlar hayatta kalır. Mutant koloni sayılarını genel olarak yaşayabilirlikle karşılaştırarak, araştırmacılar, hem eşzamanlı hem de tarihsel kontroller üzerinde tekrarlanabilir bir şekilde yükseltilirse genotoksik potansiyeli gösteren bir mutasyon frekansını belirler.

TK Tahlilleri (OECD 490 & OECD 476)

.TK Deneyi L5178Y fare lenfoma hücreleri (OECD 490) veya CHO hücreleri (OECD 476) timidin kinaz lokusunda heterozigot tasarlanmıştır. Kimyasal maruziyet ± S9 karışımını takiben, hücreler geri kazanır ve TK -verimli hücreleri öldüren triflorotimidin içeren ortam içinde kaplanır. Hayatta kalan TK⁻ mutantları 10-14 gün boyunca koloniler oluşturur, küçük katman mutantları genellikle kromozomal olayları yansıtır ve nokta mutasyonlarını yansıtan büyük koloni mutantlar. HPRT/HGPRT tahlilinde olduğu gibi, sıkı sitotoksisite kontrolleri ve pozitif mutajen ölçütleri, mutasyon frekansında gözlenen artışların bir bileşiğin genotoksik riskini güvenilir bir şekilde yansıtmasını sağlar.

4. 4. Kanser Riski Değerlendirmesi

İndüklenen sıçan karaciğeri S9, kanser / maddelerin potansiyeline neden olan çalışmalarda da kullanılmaktadır. İnsan karaciğerinde meydana gelen metabolik süreçleri simüle ederek, S9 fraksiyonu, DNA'ya bağlanabilen ve kansere yol açabilecek mutasyonlara neden olabilecek reaktif metabolitlerin oluşumuna yol açabilecek bileşiklerin tanımlanmasına yardımcı olabilir.

İndüklenmiş Hamster Karaciğer S9 ile Geliştirilmiş Ames Testi

Avrupa İlaç Ajansı (EMA) tarafından yayınlanan en son kılavuzlara göre, geleneksel Ames testi, diğerlerinin yanı sıra, bazı N - nitrosamin safsızlıklarının, özellikle N - nitrosodimetilamin (NDMA) mutajenik potansiyelini tespit edecek kadar hassas olmayabilir. Bu nedenle, ABD Gıda ve İlaç İdaresi'nin (FDA) bir bölümü olan Ulusal Toksikolojik Araştırmalar Merkezi (NCTR) tarafından geliştirilen geliştirilmiş Ames testi daha güvenilir bir alternatif olarak önerilmiştir. Gelişmiş Ames testi,% 30 sıçan karaciğeri S9 ve% 30 hamster karaciğer S9 içeren indüklenmiş hamster karaciğer S9 eklenmiştir. Sıçan ve hamster desmozomal süpernatanlar (S9S), sitokrom P450 enzim - indükleyici maddelerle tedavi edilen kemirgen karaciğerlerinden hazırlanmalıdır. İndüklenen hamster karaciğeri S9 kullanarak, bu gelişmiş test insan metabolizmasını daha iyi simüle eder ve sonuçların güvenilirliğini arttırır.

Çözüm

İndüklenen sıçan karaciğeri S9, genotoksisite testinde kritik bir araç görevi görür ve araştırmacıların ve düzenleyici ajansların kimyasalların mutajenik ve kanserojen potansiyelini değerlendirmelerine yardımcı olur. Metabolik bir aktivasyon sistemi sağlayarak, metabolik aktivasyonun genotoksik hale gelmesini gerektiren maddeleri tespit etmek için Ames testi, mutasyon testleri ve CYP450 aktivite çalışmaları gibi deneylerin yeteneğini arttırır. Uygulamaları, yeni ilaçların, kimyasalların ve tüketici ürünlerinin güvenliğini sağlamak için gereklidir. İnsan karaciğer metabolizmasının simülasyonundaki rolüyle, uyarılmış sıçan karaciğeri S9 fraksiyonu, modern toksikoloji ve düzenleyici güvenlik değerlendirmelerinin vazgeçilmez bir parçası olmaya devam etmektedir.