Індукована фракція печінки щурів S9: система метаболічної активації для тестів на генотоксичність in vitro та мутації

Ключові слова: OECD 471, OECD 473, OECD 476, OECD 487, Мутаційний тест, генотоксичність, генетична токсичність, індукована печінка щурів S9, тест Еймса, міні -тест Еймса, хромосомна аберація, Micronucleus, HPRT/HGPRT, аналіз TK

Продукт IPHASE

Вступ

Індукована печінка щурів S9є ключовим компонентом в оцінцігенетична токсичністьПотенціал хімічних речовин, особливо в регуляторній токсикології. Він зазвичай використовується в поєднанні з аналізами in vitro, такими якТест Еймса імутаційні тести, для оцінки мутагенних властивостей сполук. Забезпечуючи ферментативну систему, багату цитохромом Р450 (CYP450), індукована фракція печінки щурів S9 відіграє вирішальну роль у моделюванні метаболічних процесів, що виникають у печінці, допомагаючи визначити, чи можуть хімічні речовини, потенційно спричинити генетичні мутації чи рак.

Індукована печінка щурів S9

Фракція печінки S9 відноситься до посади - мітохондріального супернатанту, отриманого з гомогенатів печінки щурів після ряду кроків центрифугування. Термін "індукований" відноситься до лікування щурів із специфічними сполуками, які посилюють активність ферментів печінки, зокрема, ферменти цитохрому Р450 (CYP450), які відповідають за метаболізм широкого спектру ксенобіотика.

Індукована фракція печінки щурів S9 містить різноманітні ферменти, які беруть участь у метаболізмі фази I та фази II. Сюди входять такі ферменти, як цитохром P450 монооксигенази, які полегшують окислювальну біотрансформацію субстратів, тим самим імітуючи метаболізм печінки людини.

Активність CYP450 та метаболічна активація

Сім'я ферментів цитохрому Р450 (CYP450) відіграє ключову роль у метаболізмі найрізноманітніших речовин, включаючи багато фармацевтичних препаратів, хімічних речовин навколишнього середовища та канцерогенів. Індукована фракція печінки щурів S9 містить ці ферменти і є важливою для оцінки хімічних речовин, які можуть стати генотоксичними лише після метаболічної активації.

Багато сполук спочатку не - токсичні, але можуть стати токсичними після метаболізму в печінці. Ці про - мутагени (які потребують метаболічної активації, щоб стати мутагенними) та про - канцерогенів (які потребують активації, щоб викликати рак) можуть бути виявлені лише за допомогою аналізів, які включають систему метаболічної активації S9. Без індукції метаболічних ферментів, таких як CYP450, ці речовини можуть здатися нешкідливими в стандартних тестах генотоксичності.

Додавши індуковану печінку печінки щурів до аналізів in vitro, дослідники можуть оцінити, як речовина взаємодіє з ферментами CYP450. Це особливо важливо для фармацевтичних препаратів, оскільки метаболізм ферментів CYP450 є критичним кроком у фармакокінетиці багатьох препаратів.

Застосування індукованої печінки щурів S9

1. 1. Тест Емеса (OECD 471)

Тест Емеса, викладений у керівництвіOECD 471, є одним з найбільш добре відомих і широко використовуваних методів оцінки мутагенності. Він передбачає викриття штамів бактерій сальмонели до тестової хімічної речовини, щоб побачити, чи індукує мутації, які змушують бактерії повернутися до гістидину - незалежного стану.

Для моделювання метаболічного процесу людини індукована печінка печінки щурів часто додається до тестової системи. Фракція S9 забезпечує необхідні ферменти, включаючи CYP450, які можуть знадобитися для метаболізації сполуки в більш реакційноздатну форму, яка може спричинити мутації в бактеріальній ДНК. Це поєднання S9 з тестом Емеса дозволяє більш всебічно оцінити мутагенний потенціал, наслідуючи як прямі, так і метаболічно активовані мутагенні механізми.

2. 2.Мутаційні тести (хромосомний тест на аберацію, тест на мікроуклеус та інші аналізи in vitro)

На додаток до тесту Емеса, для оцінки генотоксичного потенціалу хімічних речовин зазвичай використовуються тести на мутації. Ці тести є більш вичерпними при оцінці цілого ряду генетичних пошкоджень, включаючи хромосомні мутації, мутації генів та утворення мікроуклеїв. Індукована печінка щурів S9 використовується в мутаційних тестах з наступних причин:

Тест Micronucleus (OECD 487)

Цей тест виявляє утворення мікроядерів у клітинах, які є невеликими, позашкрутними тілами, що містять фрагменти хромосом або цілі хромосоми, які не були включені в ядро ​​під час поділу клітин. З Тест MicronucleusМоже виявити кластогенну (хромосома - розрив) та анеуггенні (впливаючи на число хромосоми). Індукована печінка щурів S9 використовується тут для активації метаболічно випробувальної речовини, оскільки деякі хімічні речовини спричиняють лише хромосомні ураження, коли вони метаболізуються ферментами печінки. Фракція S9 підвищує чутливість тесту шляхом моделювання метаболічної активації, яка може відбуватися in vivo.

Хромосомний тест на аберацію (OECD 473)

Цей тест оцінює, чи може речовина спричинити структурне пошкодження хромосом, індукуючи розриви, делеції, транслокації чи інші типи аберацій. Як і тест Micronucleus,Хромосомний тест на абераціюможна наносити з метаболічною активацією або без нього. Індуковану печінку щурів S9 додається до тестової системи для імітації метаболічних процесів у печінці, що дозволяє оцінити речовини, які можуть не спричинити хромосомне пошкодження в їх первісному вигляді, але могли це зробити після метаболізму печінки.

Таблиця 1. Порівняльні міркування мутаційних тестів

Аналіз HPRT/HGPRT (OECD 476)

УАналіз HPRT/HGPRT, культури китайського хом'яка (CHO або V79) або клітини лімфобластоїдів людини (TK6) піддаються тестовому хімічному речовині в присутності індукованої метаболічної суміші печінки щурів S9, яка постачає ферменти CYP450, необхідні для перетворення про -мутагенів у види, реактивні ДНК. Після короткого лікування та семиденного періоду експресії клітини оскаржуються з 6 -тиогуаніном; Виживають лише клони, що несуть мутації функції втрату в гені фосфорибозилтрансферази гіпоксантину -гуаніну. Порівнюючи кількість мутантних колоній із загальною життєздатністю, дослідники визначають частоту мутації, яка, якщо відтворюватися як на одночасному, так і в історичному контролі, вказує на генотоксичний потенціал.

TK аналізи (OECD 490 & OECD 476)

ЗТ. використовує або клітини лімфоми миші L5178y (OECD 490), або клітини CHO (OECD 476) Інженерний гетерозигот у локусі тимідинкінази. Після хімічної експозиції ± S9 суміші клітини відновлюються і покладаються в середовище, що містить трифторотимідин, який вбиває Profifience TK. Вижили мутанти Tk⁻ утворюють колонії протягом 10–14 днів, з множинними мутантами, які часто відображають хромосомні події та мутанти з великими коленіями, що відображають точкові мутації. Як і в аналізі HPRT/HGPRT, суворі цитотоксичність контролю та позитивні мутагенні орієнтири забезпечують, щоб спостережувало збільшення частоти мутації надійно відображати генотоксичний ризик сполуки.

4. 4. Оцінка ризику раку

Індукована печінка щурів S9 також використовується в дослідженнях, спрямованих на оцінку раку - спричинення потенціалу речовин. Моделюючи метаболічні процеси, що відбуваються в печінці людини, фракція S9 може допомогти визначити сполуки, які можуть призвести до утворення реактивних метаболітів, здатних зв'язувати з ДНК та спричиняти мутації, які можуть призвести до раку.

Посилений тест Емеса з індукованою печінкою хом'яка S9

Відповідно до останніх вказівок, виданих Європейським агентством з лікарських засобів (EMA), традиційний тест Емеса може бути недостатньо чутливим для виявлення мутагенного потенціалу певного N - нітрозаміну, особливо N - нітрозодиметиламіну (NDMA). Таким чином, тест на посилене Емеса, розроблений Національним центром токсикологічних досліджень (NCTR), поділом американського управління продуктами харчування та лікарських засобів (FDA), рекомендується як більш надійна альтернатива. Посилений тест Емеса ввів додавання індукованої печінки хом'яка S9, який виконував у місті 30% печінки печінки щурів S9 та 30% печінки хом'яка S9. Десмосомні супернатанти щурів та хом'яків (S9) слід готувати з печінки гризунів, оброблених ферментом цитохрому Р450 - індукуючими речовинами. Використовуючи індуковану печінку хом'яка S9, цей посилений тест краще імітує метаболізм людини та підвищує надійність результатів.

Висновок

Індукована печінка щурів S9 служить критичним інструментом у тестуванні генотоксичності, допомагаючи дослідникам та регуляторним агенціям оцінювати мутагенний та канцерогенний потенціал хімічних речовин. Забезпечуючи систему метаболічної активації, вона підвищує здатність таких аналізів, як тест Емеса, мутаційні тести та дослідження активності CYP450 для виявлення речовин, які потребують метаболічної активації, щоб стати генотоксичною. Його застосування є важливими для забезпечення безпеки нових препаратів, хімікатів та споживчих продуктів. Зі своєю роль у моделюванні метаболізму печінки людини, індукована фракція печінки щурів S9 продовжує залишатися незамінною частиною сучасної токсикології та регуляторних оцінок безпеки.