Первинні гепатоцити: вирішальний інструмент для просування не - клінічних досліджень лікарських засобів in vitro

Первинні гепатоцити: вирішальний інструмент для просування не - клінічних досліджень лікарських засобів in vitro

Печінка, як основний орган для впливу наркотиків, відіграє вирішальну роль у процесах метаболізму та токсичності лікарських засобів. Первинні гепатоцити мають повний спектр клітинних характеристик та фізіологічних рівнів ферментів та кофакторів, включаючи мембрану - пов'язані ферменти, такі як цитохром p450 (змішана - функціональна оксидаза в гладких ендоплазматичних сітківках) та цитозольєвими естеразами, що охоплюють усі метаболічні шляхи, знайдені у ліверах. З цієї причини первинні гепатоцити широко розглядаються як золотий стандарт для побудови моделей печінки in vitro і надають перевагу дослідникам взаємодії з наркотиками, метаболізмом лікарських засобів та дослідженнями токсичності. Ця стаття надає огляд 2D та 3D -культурних моделей, заснованих на первинних гепатоцитах та їх застосуванні в розробці наркотиків.

Ключові слова: первинні гепатоцити, 2D вирощування, 3D -вирощування, органоїди, co - культура.

1. 1. Ізоляція первинних гепатоцитів

Виділення первинних гепатоцитів є критичним кроком у встановленні моделей печінки in vitro, причому найчастіше використовується метод перфузії колагенази. У менших тварин перфузія печінки може здійснюватися через портальну вену або нижчу порожнисту вену, тоді як більші тварини зазвичай потребують перфузії через частки або сегменти печінки. Кілька ключових факторів впливають на успішну ізоляцію гепатоцитів: По -перше, колагеназа повинна бути не - цитотоксичною. По -друге, термін перетравлення має вирішальне значення -Як під - травлення, так і над - травленням може компрометувати вихід та життєздатність гепатоцитів. По -третє, стан печінки повинен бути оптимальним, оскільки гепатоцити дуже чутливі до ішемічного пошкодження. Печінку, що використовується для препарату гепатоцитів, слід швидко охолодити, щоб знизити показники метаболізму та запобігти метаболічній гіпоксії та подальшій ішемії.

Стандарти первинних гепатоцитів, що використовуються в дослідженнях наркотиків, такі:

1. 2. Первинний гепатоцит 2D культура

Модель гепатоцитів підвіски

Він містить повний препарат Однак життєздатність гепатоцитів суспензії та активність лікарських засобів - метаболізуючі ферменти поступово зменшуються у міру збільшення часу інкубації in vitro, що обмежує час інкубації максимум 4 години. Ця модель, як правило, використовується для оцінки кліренсу препаратів із помірними та високими показниками кліренсу. Коли швидкість зазору менше 20%, точні значення зазору неможливо визначити. Традиційні гепатоциті для суспензії - моделі метаболізму in vitro є недостатніми для генерування виявлених метаболічних реакцій для повільних - метаболізуючих сполук, тим самим обмежуючи їх здатність прогнозувати швидкість кліренсу та метаболічні продукти цих сполук. Для продовження часу інкубації до 20 годин або навіть довше.

Застосування:Активність ферментів та дослідження метаболічної стійкості для малих молекул.

Малюнок 1. Процес передачі методу перенесення гепатоцитів підвіски

Джерело: Утилізація метабів наркотиків, 2012,40 (9): 1860–1865

Модель гепатоцитів

Первинні гепатоцити культивовані в 2D -системі на табличках культури з покриттям. Гепатоцити проявляють епітеліальну морфологію з виступаючими ядрами, часто представляються у бінуклеїтній формі. Недоліки одношарової культури моношару гепатоцитів включають: 1. Зміна полярності та функції клітин.2. Відсутність інших відповідних типів клітин (тобто не - паренхіматозних клітин), необхідних для нормальної функції.3. Неможливість забезпечити достатню кількість поживних речовин та паракринних факторів для підтримки гепатоцитів у виконанні своїх функцій (таких як біосинтез білка жовчної кислоти та сироватки).

Заявки:

1). Оцінка лікарських засобів - Взаємодія з наркотиками:Сюди входить індукція ферментів, інгібування ферментів та дослідження транспортерів. По -перше, коли препарат діє як індуктор, це може призвести до посилення експресії лікарських засобів - метаболізації ферментів та транспортерів. Сильні індуктори можуть одночасно регулювати кілька генів, такі як фенобарбітальна індукція CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9, UGT та декількох транспортних білків, таких як MRP2. По -друге, є види - конкретні відмінності в тому, як гепатоцити реагують на індуктори. Наприклад, рифампіцин є ефективним індуктором гепатоцитів людини та кроликів, але не має індукційного впливу на гепатоцити щурів. Нарешті, субоптимальна щільність покриття в прожекторних гепатоцитах може призвести до зниження базальної експресії p450 та штучно збільшених індукційних реакцій. Як показано на малюнку 3, гепатоцити при нижчій щільності покриття демонструють меншу базальну активність CYP1A2, CYP2B6 та CYP3A4, але сильніші індукційні реакції. Тому здорові гепатоцити при відповідній щільності покриття необхідні для отримання фізіологічно відповідних даних.

Малюнок 2. Зв'язок між щільністю покриття кріоконсервованих гепатоцитів людини та індукцією ферментів

Джерело: Поточні технології виявлення наркотиків, 2010, 7: 188 - 198

2). Оцінка гепатотоксичності: Спостереження за морфологічними змінами під світлим мікроскопом, такими як морфологія клітин, вакуольна та ліпідна крапельна агрегація та прикріплення/відшарування клітин. Виявлення некрозу гепатоцитів (як показано аспартатом амінотрансферази, лактатною дегідрогеназою та амінотрансферазою аланіну) та апоптозом (фрагментація ДНК). Для цитокіну - опосередкована цитотоксичність, одиничні моношарові культури гепатоцитів не можуть передбачити токсичні реакції внаслідок регуляції речовинами, що виділяються з сусідніх не - паренхімальних клітин, таких як клітини Купфера, зоряні клітини та синусоїдальні ендотеліальні клітини.

3). "Метод естафети" для вивчення повільного метаболізації сполук та його метаболітів: Активність лікарських засобів - метаболізація ферментів у прожекторних гепатоцитах починає зменшуватися через 24 години покриття. Після інкубації герметичних гепатоцитів із сироваткою - вільного середовища, що містить сполуку, що цікавить протягом 24 годин, середовище збирають і змішують, а потім переносять у нові гепатоцити для подальшого дослідження (рис. 3).

Малюнок 3. Процес передачі методу реле гепатоцитів

Джерело: Листи метаболізму наркотиків, 2016, 10: 3 - 15

3). Оцініть клітинне поглинання, ендоцитоз, ендосомну втечу та замовчування впливу на цільовий ген гепатоцитів - цільові препарати малої нуклеїнової кислоти.

Модель вирощування сендвічів

In vitro, гепатоцити можна культивувати між двома шарами колагену або Матрігеля для реконструкції in vivo структур, відомих як вирощування сендвічів. Гепатоцити, культивовані між двома шарами гелю - колагену (структура сендвіч) можуть покращити морфологію та життєздатність клітин та підтримувати їх функціональність протягом більш тривалого періоду. Крім того, гепатоцити в сендвіч -культурі можуть відновити полярність, що дозволяє належній локалізації базолатеральних та каналітних транспортерів, а також утворення функціональних мереж жовчних проток (мал. 4).

Малюнок 4. Поляризована експресія транспортерів у моделі сендвіч -гепатоцитів людини

Джерело: Поточні технології виявлення наркотиків, 2010, 7, 188 - 198

Заявки:

1. 1). Оцінка біліарної екскреції сполук.
2. 2). Оцінка печінкового та жовчного розподілу ендогенних та екзогенних сполук та метаболітів.
3. 3). Оцінка кліренсу, опосередкована метаболізмом та транспортерами, та побудова фізіології - Фармакокінетичні моделі на основі -
4. 4). Вивчення гепатотоксичності та забезпечення механізмів клінічного препарату - Індукована травма печінки. Дані інтегровані в моделі фармакології систем для прогнозування потенційних препаратів - Індукована травма печінки у людини.
5.  
   1. 3. Первинна культура гепатоцитів 3D

6. У системах 3D культури гепатоцити культивуються в три - розмірній матриці, що краще імітує архітектуру печінки in vivo порівняно з 2D моношарними культурами. Ці системи сприяють взаємодію клітин - клітин та клітин - матричних взаємодій, що може відновити більше фізіологічних функцій печінки, включаючи метаболізм лікарських засобів, секрецію білка та утворення жовчі. Первинні 3D -культури гепатоцитів можуть бути використані для вивчення печінки печінки - конкретні функції в більш in vivo - подібному до середовища, пропонуючи переваги для тестування на наркотики, оцінки токсичності та моделювання захворювань.

   Сфероїдна модель

За допомогою таких методів, як ультра - низька культура прикріплення, підвісна культура крапель та культуру магнітних клітин (мал. 5), первинні гепатоцити можуть агрегуватися в сфероїдальні агрегати з діаметром до 150 - 175 мкм, не покладаючись на зовнішні матриці. Однією з переваг сфероїдної культури є те, що кожен сфероїд вимагає лише 1330 - 2000 клітин, що значно зменшує кількість клітин порівняно з іншими методами 3D -культури. Останні дослідження показали, що первинні сфероїдні культури гепатоцитів можуть підтримувати до 5 тижнів, а активність ферментів CYP залишається майже незмінною між 8 -днем 35 -днем. Протеомічний аналіз виявив, що порівняно з культурою сендвічів, ферментами, що відповідають за всмоктування наркотиків, розподілу, метаболізму та виділення, краще збереглися протягом 14 днів у сфероїдній культурі. Однак печінка набагато складніша, ніж агрегат клітин. Базолатеральна сторона гепатоцитів взаємодіє з крові, тоді як жовч витікає з апікальної сторони, що є ключовою особливістю складної структури печінкових часточок, і це ще не може бути повторене в сфероїдній моделі.

Заявки:

1. 1). Вивчення повільного метаболізації сполук та його метаболітів.
2. 2). Дослідження гепатотоксичності.
3. 3). Оцінка клітинного поглинання, ендоцитозу, ендосомного втечі та замовчування впливу на гени цільових гепатоцитів - Цільові препарати малої нуклеїнової кислоти.

Малюнок 5. Метод сфероїдної культури

Модель органоїдів печінки

Визначення консенсусу органоїдів - це: 3D -структури, отримані із стовбурових клітин, клітин -попередників або диференційованих клітин, здатні відтворювати певні функції та структури нативної тканини in vitro, ефективно імітуючи мікросередовище in vivo та клітини - до - клітинних взаємодій. Органоїди печінки були визначені як найсучасніша модель досліджень біології печінки людини.

Клітинні джерела для будівництва органоїдів печінки:

① Плюрипотентні стовбурові клітини (PSC):

Ембріональні стовбурові клітини (ESC) та індуковані плюрипотентні стовбурові клітини (IPSC) мають високу плюрипотентність, пластичність та необмежену проліферативну здатність. Під впливом специфічних сигнальних факторів вони диференціюються на гепатоциті - подібні клітини з активністю та функцією. Однак органоїди печінки, отримані з ПСК, можуть зазнати епігенетичних та генетичних змін, виявляючи хромосомні зміни анеуплоїдів під час ампліфікації.

Заявки:

1. 1). Моделі генетичних захворювань печінки
2. 2). Інфекційні моделі захворювань печінки
3. 3). Тестування цитотоксичності наркотиків

② Тканина печінки - Похідні клітини: До них належать холангіоцити та гепатоцити. Зрілі гепатоцити зберігають потенціал стовбурових клітин та проліферативну здатність у конкретних середовищах. Порівняно з PSC - отриманими органоїдами, органоїди, отримані з первинної тканини, є більш зрілими, з більш стабільними геномами та підтримують фенотипічну та генетичну стабільність протягом тривалої - терміни in vitro культури. Однак тривалий - термін проліферативна здатність зрілих органоїдів гепатоцитів людини обмежена порівняно з гепатоцитами людини плода або первинними гепатоцитами миші для дорослих. Органоїди гепатоцитів для дорослих гепатоцитів залишається складним.

Метод культури (мал. 6): тканина печінки перетравлюється в одиночні клітини, а суміш матригеля та клітин висівається в 24 - свердловину, утворюючи купольні - форми структури. Інкубуйте в інкубаторі клітинної культури (37 ° С) протягом 15 хвилин. Після затвердіння додайте специфічне культуральне середовище. Прохід приблизно через 14 днів. Замініть початкове середовище на диференціаційне середовище через 7 - 10 днів.

Заявки:

1. 1). Моделі гепатотоксичності
2. 2). Дослідження розладу метаболізму in vitro
3. 3). Не - алкогольна жирна хвороба печінки
4. 4). Розвиток наркотиків для доброякісних та злоякісних захворювань печінки

Малюнок 6. Культура та процес проходження тканини - Отримані печінкові органоїди

Джерело: Cell & Bioscience (2023) 13: 197

Порівняння сфероїдної культури та органоїдної культури

4. Первинна модель гепатоцитів CO -

1. 1. 2D первинна модель гепатоцитів Co -
      

      У моделі 2D первинної гепатоцитарної культури два або більше різних типів клітин змішуються та культивуються у двох - розмірних умовах. Ключовою особливістю цієї моделі є пряма взаємодія між різними типами клітин, взаємодією між клітинами та позаклітинною матрицею, або опосередкованою передачею сигналу через цитокіни та хімічні комунікації. Первинні функції гепатоцитів, такі як виробництво альбуміну та здатність до метаболізму наркотиків, можуть підтримуватися до трьох тижнів.

      Заявки:

      1. 1). Первинні гепатоцити Co - культивовані з фібробластами: Ця модель використовується для вивчення швидкості кліренсу повільних - метаболізуючих сполук та їх метаболітів.
      2. 2). Первинні гепатоцити Co - культивовані з не - паренхіматозними клітинами печінки (наприклад, зоряними клітинами, синусоїдальними ендотеліальними клітинами): ця модель корисна для дослідження препарату - Індукована травма печінки (DILI), оскільки вона допомагає дослідити роль цитокінів, хемокінів та факторів росту в модуляції адаптивних реакцій печінки після впливу препаратів.
      3. 3). Первинні гепатоцити Co - культивовані з Т -клітинами: ця модель використовується для виявлення метаболізму препарату печінки - специфічні реакції Т -клітин.
      4. 4). Hepatomax ™ Iphase ™CO - Система культури: IPHASE розробила систему культури з первинними гепатоцитами різних видів, відомі як Hepatomax™. Під час культивування первинних гепатоцитів людини з стромальними клітинами можна підтримувати хороший препарат - метаболізація активності ферментів у гепатоцитах людини до 3 тижнів. Ця система підходить для вивчення повільного - метаболізації коефіцієнтів кліренсу та їх метаболітів.

      Ця модель культури забезпечує більш фізіологічно релевантну платформу для оцінки метаболізму наркотиків, токсичності та процесів, пов'язаних з печінкою, пропонуючи розуміння того, як різні типи клітин сприяють функції та захворювання печінки.
      
      

      3D первинна модель гепатоцитів Co -

      Прямий 3D CO - Культура: Ця модель передбачає змішування двох або більше різних типів клітин печінки (наприклад, первинних гепатоцитів, синусоїдальних ендотеліальних клітин, печінкових зоряних клітин, клітин Купфера) для формування само - зібраних сфероїдів або ко -- культивування в 3D -середовищі, побудованому з такими матеріалами, як колаген, фібрин, альгінат або гідрогеля. Пряма 3D CO - культура дозволяє тісно взаємодію між різними клітинами печінки за допомогою таких механізмів, як клітина - до - адгезії клітин, паракринна сигналізація за допомогою розчинних цитокінів та адгезії позаклітинної матриці, що дозволяє зв’язати між гепатоцитами.

      Заявки:

      1. 1). Модель фіброзу печінки: використовується для вивчення механізмів та прогресування фіброзу печінки.
      2. 2). Препарат - Модель травми печінки (DILI): допомагає моделювати та оцінювати ураження печінки, спричинені препаратами.
      3. 3). Взаємодія наркотиків, метаболізм лікарських засобів та індукція ферментів: оцінює, як взаємодіють різні препарати, як вони метаболізуються та як вони індукують ферменти печінки.

      Непрямі 3D CO - Культура: Цей метод використовує систему фізичного поділу (наприклад, трансуелл або інші матеріали) для культури двох або більше типів клітин (таких як первинні гепатоцити з клітинами NIH/3T3 або синусоїдальними ендотеліальними клітинами) у 3D -середовищі, де запобігається прямі клітини - клітини. Спілкування між клітинами відбувається через розчинні цитокіни.

      Заявки:
      Використовується для вивчення не - контактної комунікації між клітинами печінки в організмі.

      
      Підсумовуючи, IPHASE, як лідер у галузі біологічних досліджень in vitro, забезпечує всебічні рішення для не - клінічного тестування на наркотики. Від ізоляції та культури первинних гепатоцитів від різних видів до розробки допоміжних продуктів, таких як культурні медіа для конкретних застосувань або багато - специфікаційних колагенів - покриті пластинами, IPHASE присвячена пропонування найкращих інструментів дослідження in vitro для виявлення та розвитку наркотиків. Ми є довіреним партнером для клієнтів у фармацевтичній галузі, яка прагне забезпечити різання - Edge Solutions для не - клінічних досліджень.