Tế bào gan nguyên phát: Một công cụ quan trọng để tiến hành nghiên cứu thuốc in vitro không -

Tế bào gan nguyên phát: Một công cụ quan trọng để tiến hành nghiên cứu thuốc in vitro không -

Gan, là cơ quan chính để tiếp xúc với thuốc, đóng một vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa thuốc và độc tính. Các tế bào gan nguyên phát sở hữu toàn bộ các đặc điểm tế bào và mức độ sinh lý của enzyme và cofactors, bao gồm các enzyme liên kết của màng như cytochrom P450 (một hỗn hợp - chức năng oxyase trong các đường dẫn động mạch chủ. Vì lý do này, các tế bào gan nguyên phát được coi là tiêu chuẩn vàng để xây dựng các mô hình gan in vitro và được các nhà nghiên cứu ưa chuộng trong tương tác thuốc, chuyển hóa thuốc và nghiên cứu độc tính. Bài viết này cung cấp một cái nhìn tổng quan về các mô hình nuôi cấy 2D và 3D dựa trên tế bào gan chính và các ứng dụng của chúng trong phát triển thuốc.

Từ khóa: tế bào gan chính, canh tác 2D, canh tác 3D, organoids, Co - Văn hóa.

1. 1. Phân lập tế bào gan nguyên phát

Sự phân lập của tế bào gan nguyên phát là một bước quan trọng trong việc thiết lập các mô hình gan in vitro, với phương pháp tưới máu hai bước collagenase được sử dụng phổ biến nhất. Ở động vật nhỏ hơn, tưới máu gan có thể được thực hiện thông qua tĩnh mạch cổng hoặc tĩnh mạch chủ kém, trong khi các động vật lớn hơn thường cần tưới máu qua thùy hoặc phân đoạn gan. Một số yếu tố chính ảnh hưởng đến sự phân lập thành công của tế bào gan: Đầu tiên, collagenase phải không gây độc tế bào. Thứ hai, thời điểm tiêu hóa là rất quan trọngcả dưới - tiêu hóa và trên - tiêu hóa có thể thỏa hiệp sản lượng tế bào gan và khả năng tồn tại. Thứ ba, tình trạng gan phải là tối ưu, vì tế bào gan rất nhạy cảm với tổn thương do thiếu máu cục bộ. Gan được sử dụng để chuẩn bị tế bào gan nên được làm mát nhanh chóng để giảm tỷ lệ trao đổi chất và ngăn ngừa tình trạng thiếu oxy trao đổi chất và thiếu máu cục bộ tiếp theo.

Các tiêu chuẩn cho các tế bào gan nguyên phát được sử dụng trong nghiên cứu thuốc như sau:

1. 2. Nuôi cấy 2D tế bào gan nguyên phát

Mô hình tế bào gan đình chỉ

Nó chứa thuốc hoàn chỉnh - Các enzyme chuyển hóa và đồng yếu tố, làm cho nó phù hợp để nghiên cứu các con đường giải phóng trao đổi chất khác nhau. Tuy nhiên, khả năng tồn tại của các tế bào gan huyền phù và hoạt động của thuốc - chuyển hóa các enzyme giảm dần khi thời gian ủ bệnh trong ống nghiệm tăng lên, hạn chế thời gian ủ bệnh tối đa là 4 giờ. Mô hình này thường được sử dụng để ước tính độ thanh thải của các loại thuốc có tỷ lệ giải phóng mặt bằng từ trung bình đến cao. Khi tỷ lệ giải phóng mặt bằng nhỏ hơn 20%, giá trị giải phóng mặt bằng chính xác không thể được xác định. Huyền hiệu truyền thống tế bào gan - Các mô hình chuyển hóa trong ống nghiệm không đủ để tạo ra các phản ứng trao đổi chất có thể phát hiện được cho các hợp chất chuyển hóa chậm -, do đó hạn chế khả năng dự đoán tốc độ giải phóng mặt bằng và các sản phẩm trao đổi chất của các hợp chất này. Một phương pháp chuyển tiếp tế bào gan huyền phù (Hình 1) có thể được sử dụng để kéo dài thời gian ủ lại đến 20 giờ hoặc thậm chí lâu hơn.

Ứng dụng:Hoạt động của enzyme và nghiên cứu ổn định trao đổi chất cho các loại thuốc phân tử nhỏ.

Hình 1. Quá trình chuyển phương pháp chuyển tiếp tế bào gan đình chỉ

Nguồn: Metab Metab Dispos, 2012,40 (9): 1860 Từ1865

Mô hình tế bào gan có thể sử dụng được

Các tế bào gan nguyên phát được nuôi cấy trong hệ thống 2D trên các tấm nuôi cấy collagen - Các tế bào gan thể hiện một hình thái biểu mô, với các hạt nhân nhô ra, thường xuất hiện ở dạng nhị phân. Những hạn chế của nuôi cấy đơn lớp tế bào gan đơn bao gồm: 1. Sự thay đổi của sự phân cực và chức năng của tế bào.2. Thiếu các loại tế bào có liên quan khác (nghĩa là, các tế bào không phải - tế bào nhu mô) được yêu cầu cho chức năng bình thường.3. Không có khả năng cung cấp đủ chất dinh dưỡng và các yếu tố paracrine để hỗ trợ tế bào gan trong việc thực hiện các chức năng của chúng (như axit mật và sinh tổng hợp protein huyết thanh).

Ứng dụng:

1). Đánh giá thuốc - Tương tác thuốc:Điều này bao gồm cảm ứng enzyme, ức chế enzyme và nghiên cứu vận chuyển. Đầu tiên, khi một loại thuốc hoạt động như một chất cảm ứng, nó có thể dẫn đến sự biểu hiện tăng của thuốc - chuyển hóa các enzyme và chất vận chuyển. Các chất gây cảm ứng mạnh mẽ có thể điều chỉnh đồng thời nhiều gen, chẳng hạn như cảm ứng phenobarbital của CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9, UGT và một số protein vận chuyển như MRP2. Thứ hai, có những loài - khác biệt cụ thể về cách tế bào gan phản ứng với các chất gây cảm ứng. Ví dụ, rifampicin là một chất gây cảm ứng hiệu quả đối với tế bào gan ở người và thỏ, nhưng không có tác dụng cảm ứng đối với tế bào gan chuột. Cuối cùng, mật độ mạ dưới mức tối ưu của tế bào gan có thể làm được có thể dẫn đến giảm biểu hiện cơ bản của P450 và các phản ứng cảm ứng tăng nhân tạo. Như được hiển thị trong Hình 3, các tế bào gan ở mật độ mạ thấp hơn cho thấy hoạt động cơ bản thấp hơn của CYP1A2, CYP2B6 và CYP3A4, nhưng phản ứng cảm ứng mạnh hơn. Do đó, các tế bào gan khỏe mạnh ở mật độ mạ thích hợp là cần thiết để có được dữ liệu liên quan đến sinh lý.

Hình 2. Mối quan hệ giữa mật độ mạ của tế bào gan người được bảo quản lạnh và cảm ứng enzyme

Nguồn: Công nghệ khám phá thuốc hiện tại, 2010, 7: 188 - 198

2). Đánh giá độc tính gan: Quan sát những thay đổi hình thái dưới kính hiển vi ánh sáng, chẳng hạn như hình thái tế bào, tập hợp không bào và lipid và sự gắn/tách tế bào. Phát hiện hoại tử tế bào gan (như được chỉ định bởi aspartate aminotransferase, lactate dehydrogenase và alanine aminotransferase) và apoptosis (phân mảnh DNA). Đối với độc tính tế bào qua trung gian, nuôi cấy tế bào gan đơn lớp đơn lớp không thể dự đoán các phản ứng độc hại do sự điều hòa của các chất được giải phóng từ các tế bào nội sinh lân cận, như tế bào Kupffer, tế bào sao và tế bào nội mô hình sin.

3). "Phương pháp rơle" để nghiên cứu về độ thanh thải hợp chất chuyển hóa chậm và các chất chuyển hóa của nó: Hoạt động của thuốc - Các enzyme chuyển hóa trong tế bào gan có thể bắt đầu giảm sau 24 giờ mạ. Sau khi ủ các tế bào gan có thể làm được với huyết thanh - Môi trường tự do chứa hợp chất quan tâm trong 24 giờ, môi trường được thu thập và trộn, sau đó chuyển sang tế bào gan có thể sử dụng được để nghiên cứu thêm (Hình 3).

Hình 3. Quá trình chuyển phương pháp chuyển tiếp tế bào gan có thể làm được

Nguồn: Thư chuyển hóa thuốc, 2016, 10: 3 - 15

3). Đánh giá sự hấp thu của tế bào, endocytosis, thoát nội sinh và tác dụng im lặng đối với gen mục tiêu của tế bào gan - nhắm mục tiêu các thuốc axit nucleic nhỏ.

Mô hình canh tác bánh sandwich

Trong ống nghiệm, tế bào gan có thể được nuôi cấy giữa hai lớp collagen hoặc Matrigel để tái tạo các cấu trúc in vivo, được gọi là canh tác bánh sandwich. Các tế bào gan được nuôi cấy giữa hai lớp gel - collagen (cấu trúc bánh sandwich) có thể cải thiện hình thái và khả năng tồn tại của các tế bào, và duy trì chức năng của chúng trong một thời gian dài hơn. Hơn nữa, tế bào gan trong nuôi cấy bánh sandwich có thể khôi phục sự phân cực, cho phép nội địa hóa đúng các chất vận chuyển cơ bản và ống dẫn, cũng như sự hình thành các mạng lưới ống mật chức năng (Hình 4).

Hình 4. Biểu hiện phân cực của các chất vận chuyển trong mô hình bánh sandwich tế bào gan của con người

Nguồn: Công nghệ khám phá thuốc hiện tại, 2010, 7, 188 - 198

Ứng dụng:

1. 1). Ước tính bài tiết đường mật của các hợp chất.
2. 2). Đánh giá sự phân bố gan và đường mật của các hợp chất và chất chuyển hóa nội sinh và ngoại sinh.
3. 3). Ước tính giải phóng mặt bằng qua trung gian trao đổi chất và vận chuyển, và xây dựng sinh lý học - Các mô hình dược động học dựa trên.
4. 4). Nghiên cứu độc tính gan và cung cấp các cơ chế cho thuốc lâm sàng - gây ra tổn thương gan. Dữ liệu được tích hợp vào các mô hình dược lý hệ thống để dự đoán thuốc tiềm năng - gây tổn thương gan ở người.
5.  
   1. 3. Nuôi cấy 3D tế bào gan nguyên phát

6. Trong các hệ thống nuôi cấy 3D, tế bào gan được nuôi cấy trong ma trận ba chiều, bắt chước tốt hơn kiến ​​trúc gan in vivo so với nuôi cấy đơn lớp 2D. Các hệ thống này thúc đẩy các tương tác tế bào và tế bào - Ma trận, có thể khôi phục nhiều chức năng sinh lý của gan, bao gồm chuyển hóa thuốc, bài tiết protein và hình thành mật. Nuôi cấy 3D tế bào gan nguyên phát có thể được sử dụng để nghiên cứu các chức năng cụ thể của gan - trong một môi trường hơn in vivo, như mang lại lợi thế cho xét nghiệm thuốc, đánh giá độc tính và mô hình bệnh.

   Mô hình hình cầu

Thông qua các kỹ thuật như Ultra - nuôi cấy thấp, nuôi cấy thả và nuôi cấy tế bào từ tính (Hình 5), tế bào gan nguyên phát có thể tổng hợp thành các tập hợp hình cầu có đường kính lên tới 150 - 175. Một lợi thế của nuôi cấy hình cầu là mỗi hình cầu chỉ cần 1.330 - 2.000 tế bào, làm giảm đáng kể số lượng tế bào so với các kỹ thuật nuôi cấy 3D khác. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng nuôi cấy hình cầu tế bào gan nguyên phát có thể duy trì trong tối đa 5 tuần, với hoạt động của enzyme CYP vẫn gần như không thay đổi giữa ngày 8 và ngày 35. Phân tích proteomics cho thấy, so với nuôi cấy bánh sandwich, enzyme chịu trách nhiệm hấp thụ thuốc, phân phối, chuyển hóa và tiết ra tốt hơn trong 14 ngày. Tuy nhiên, gan phức tạp hơn nhiều so với tập hợp tế bào. Mặt cơ bản của tế bào gan tương tác với máu, trong khi mật chảy ra từ phía đỉnh, đây là một đặc điểm chính của cấu trúc thùy gan phức tạp, và điều này chưa thể được sao chép trong mô hình hình cầu.

Ứng dụng:

1. 1). Nghiên cứu về độ thanh thải hợp chất chuyển hóa chậm và các chất chuyển hóa của nó.
2. 2). Nghiên cứu độc tính gan.
3. 3). Đánh giá sự hấp thu của tế bào, endocytosis, thoát nội sinh và tác dụng im lặng đối với các gen mục tiêu của tế bào gan - nhắm mục tiêu các thuốc axit nucleic nhỏ.

Hình 5. Phương pháp nuôi cấy hình cầu

Mô hình organoids gan

Định nghĩa đồng thuận của organoids là: cấu trúc 3D có nguồn gốc từ các tế bào gốc, tế bào tiền thân hoặc các tế bào biệt hóa, có khả năng tái tạo các chức năng và cấu trúc của mô tự nhiên in vitro, bắt chước hiệu quả vi mô in vivo và tế bào - với các tương tác tế bào. Các cơ quan gan đã được xác định là mô hình tiên tiến nhất cho nghiên cứu sinh học gan người.

Nguồn tế bào để xây dựng organoid gan:

Tế bào gốc đa năng (PSCS):

Tế bào gốc phôi (ESC) và các tế bào gốc đa năng gây ra (IPSC) có khả năng đa năng cao, độ dẻo và khả năng tăng sinh không giới hạn. Dưới ảnh hưởng của các yếu tố tín hiệu cụ thể, chúng phân biệt thành tế bào gan - giống như các tế bào có hoạt động và chức năng. Tuy nhiên, các cơ quan gan có nguồn gốc từ PSC có thể trải qua sự thay đổi biểu sinh và di truyền, thể hiện sự thay đổi dị tật nhiễm sắc thể trong quá trình khuếch đại.

Ứng dụng:

1. 1). Mô hình bệnh gan di truyền
2. 2). Mô hình bệnh gan truyền nhiễm
3. 3). Thử nghiệm độc tế bào thuốc

Mô gan - Các tế bào có nguồn gốc: Chúng bao gồm các tế bào cholangiocytes và tế bào gan. Các tế bào gan trưởng thành giữ lại tiềm năng tế bào gốc và khả năng tăng sinh trong các môi trường cụ thể. So với PSC - Organoids có nguồn gốc, các cơ quan có nguồn gốc từ mô chính trưởng thành hơn, với bộ gen ổn định hơn và duy trì sự ổn định kiểu hình và di truyền trong quá trình nuôi cấy dài hạn. Tuy nhiên, khả năng tăng sinh dài hạn của các cơ quan tế bào gan ở người trưởng thành bị hạn chế so với tế bào gan ở người hoặc tế bào gan nguyên phát chuột trưởng thành. Nuôi cấy organoids tế bào gan trưởng thành vẫn còn thách thức.

Phương pháp nuôi cấy (Hình 6): Mô gan được tiêu hóa thành các tế bào đơn lẻ, và một hỗn hợp của Matrigel và các tế bào được gieo vào một tấm 24 - tốt để tạo thành các cấu trúc hình vòm -. Ủ trong máy ấp trứng nuôi cấy tế bào (37 ° C) trong 15 phút. Sau khi hóa rắn, thêm môi trường nuôi cấy cụ thể. Đoạn văn sau khoảng 14 ngày. Thay thế phương tiện ban đầu bằng phương tiện khác biệt sau 7 - 10 ngày.

Ứng dụng:

1. 1). Mô hình độc tính gan
2. 2). Các nghiên cứu rối loạn chuyển hóa in vitro
3. 3). Không - Bệnh gan béo
4. 4). Phát triển thuốc cho các bệnh gan lành tính và ác tính

Hình 6. Quá trình nuôi cấy và đi qua mô - organoids có nguồn gốc

Nguồn: Cell & Bioscience (2023) 13: 197

So sánh nuôi cấy hình cầu và nuôi cấy organoid

4.

1. 1. CO gan nguyên phát 2D CO - Mô hình nuôi cấy
      

      Trong mô hình nuôi cấy tế bào gan chính 2D, hai hoặc nhiều loại tế bào khác nhau được trộn lẫn và nuôi cấy trong môi trường hai chiều. Đặc điểm chính của mô hình này là sự tương tác trực tiếp giữa các loại tế bào khác nhau, sự tương tác giữa các ô và ma trận ngoại bào hoặc truyền tín hiệu gián tiếp thông qua các cytokine và liên lạc hóa học. Các chức năng tế bào gan nguyên phát, như sản xuất albumin và khả năng chuyển hóa thuốc, có thể được duy trì trong tối đa ba tuần.

      Ứng dụng:

      1. 1). Tế bào gan nguyên phát Co - được nuôi cấy với nguyên bào sợi: Mô hình này được sử dụng để nghiên cứu tốc độ giải phóng mặt bằng của các hợp chất chuyển hóa chậm và các chất chuyển hóa của chúng.
      2. 2). Các tế bào gan nguyên phát Co - nuôi cấy với các tế bào gan không - nhu mô (ví dụ, các tế bào sao, tế bào nội mô hình sin): mô hình này rất hữu ích cho việc nghiên cứu thuốc - gây tổn thương gan (DILI), vì nó giúp điều tra vai trò của các cytok, và các yếu tố tăng trưởng trong phản ứng của gan.
      3. 3). Tế bào gan nguyên phát CO - Nuôi cấy các tế bào T: Mô hình này được sử dụng để phát hiện chuyển hóa thuốc gan - Phản ứng tế bào T cụ thể.
      4. 4). Hepatomax ™ của IphaseCO - Hệ thống nuôi cấy: Iphase đã phát triển một hệ thống nuôi cấy CO - với tế bào gan nguyên phát từ các loài khác nhau, được gọi là Hepatomax™. Bằng cách nuôi cấy tế bào gan nguyên phát của con người với các tế bào cơ địa, có thể duy trì thuốc tốt - hoạt động của enzyme chuyển hóa ở tế bào gan ở người trong tối đa 3 tuần. Hệ thống này phù hợp để nghiên cứu chậm - Tốc độ thanh thải hợp chất và các chất chuyển hóa của chúng.

      Mô hình văn hóa Co - này cung cấp một nền tảng có liên quan đến sinh lý hơn để đánh giá quá trình chuyển hóa thuốc, độc tính và gan - Các quá trình bệnh liên quan, đưa ra những hiểu biết sâu sắc về cách các loại tế bào khác nhau đóng góp vào chức năng và bệnh gan.
      
      

      3D HEPATOCYTY CO - Mô hình nuôi cấy

      Công ty 3D trực tiếp - Văn hóa: Mô hình này liên quan đến việc trộn hai hoặc nhiều loại tế bào gan khác nhau (ví dụ: tế bào gan nguyên phát, tế bào nội mô hình sin, tế bào sao gan, tế bào Kupffer) để tạo thành các hình cầu tự do tự lắp ráp hoặc nuôi cấy chúng trong môi trường 3D được xây dựng với các vật liệu như collagen Trực tiếp 3D CO - nuôi cấy cho phép tương tác chặt chẽ giữa các tế bào gan khác nhau thông qua các cơ chế như tế bào - đến - sự kết dính của tế bào, tín hiệu paracrine thông qua các cytokine hòa tan và độ bám dính của ma trận ngoại bào, cho phép giao tiếp giữa các tế bào gan.

      Ứng dụng:

      1. 1). Mô hình xơ gan: Được sử dụng để nghiên cứu các cơ chế và sự tiến triển của xơ gan.
      2. 2). Thuốc - Mô hình tổn thương gan (DILI) gây ra: Giúp mô phỏng và đánh giá tổn thương gan do thuốc.
      3. 3). Tương tác thuốc, chuyển hóa thuốc và cảm ứng enzyme: đánh giá cách các loại thuốc khác nhau tương tác, cách chúng được chuyển hóa và cách chúng tạo ra các enzyme gan.

      Công ty 3D gián tiếp - Văn hóa: Phương pháp này sử dụng một hệ thống phân tách vật lý (ví dụ: transwell hoặc các vật liệu khác) để nuôi cấy hai hoặc nhiều loại tế bào (như tế bào gan nguyên phát với các tế bào NIH/3T3 hoặc tế bào nội mô hình sin) trong môi trường 3D, trong đó các tế bào trực tiếp - tiếp xúc với tế bào. Sự giao tiếp giữa các tế bào xảy ra thông qua các cytokine hòa tan.

      Ứng dụng:
      Được sử dụng để nghiên cứu không phải là giao tiếp tiếp xúc giữa các tế bào gan trong cơ thể.

      
      Tóm lại, iphase, với tư cách là một nhà lãnh đạo trong nghiên cứu sinh học in vitro, cung cấp các giải pháp toàn diện cho xét nghiệm thuốc không phải là - Từ sự cô lập và nuôi cấy tế bào gan nguyên phát từ các loài khác nhau đến sự phát triển của các sản phẩm hỗ trợ như môi trường nuôi cấy cho các ứng dụng cụ thể hoặc đa đặc điểm kỹ thuật collagen - Các tấm phủ, iphase được dành riêng để cung cấp các công cụ nghiên cứu in vitro tốt nhất để phát hiện và phát triển thuốc. Chúng tôi là một đối tác đáng tin cậy cho các khách hàng trong ngành dược phẩm, cam kết cung cấp các giải pháp cắt - cạnh cho nghiên cứu lâm sàng.