خلايا الكبد الأولية: أداة حاسمة للتقدم في أبحاث الأدوية في المختبر في المختبر

خلايا الكبد الأولية: أداة حاسمة للتقدم في أبحاث الأدوية في المختبر في المختبر

يلعب الكبد ، بصفته العضو الرئيسي للتعرض للمخدرات ، دورًا مهمًا في عملية التمثيل الغذائي للدواء وعمليات السمية. تمتلك الخلايا الكبدية الأولية الطيف الكامل للخصائص الخلوية والمستويات الفسيولوجية للإنزيمات والعوامل المساعدة ، بما في ذلك الأنزيمات الغشائية - المرتبطة مثل السيتوكروم P450 (A مختلطة - أوكسيديز في الوظيفية في الشبكية الإندوبلازمية الملساء) والاسترات السيتروسيلية ، مما يمنح جميع مسارات الميتابوليك. لهذا السبب ، تعتبر الخلايا الكبدية الأولية على نطاق واسع المعيار الذهبي للبناء في نماذج الكبد المختبري ويفضلها الباحثون في التفاعل بين المخدرات ، واستقلاب المخدرات ، ودراسات السمية. توفر هذه المقالة نظرة عامة على نماذج الثقافة ثنائية الأبعاد وثلاثة عشر على أساس خلايا الكبد الأولية وتطبيقاتها في تطوير الأدوية.

الكلمات المفتاحية: خلايا الكبد الأولية ، زراعة ثنائية الأبعاد ، زراعة ثلاثية الأبعاد ، أعضاء ، CO - الثقافة.

1. 1. عزل الخلايا الكبدية الأولية

تعتبر عزل الخلايا الكبدية الأولية خطوة مهمة في إنشاء نماذج الكبد في المختبر ، مع أن طريقة نضح الكولاجيناز الخطوة هي الأكثر استخدامًا. في الحيوانات الأصغر ، يمكن إجراء نضح الكبد عبر الوريد البابي أو Vena Cava السفلي ، في حين أن الحيوانات الكبيرة تتطلب عادة نضحًا من خلال فصوص الكبد أو الأجزاء. تؤثر العديد من العوامل الرئيسية على العزلة الناجحة لخلايا الكبد: أولاً ، يجب أن تكون الكولاجيناز غير سامة للخلايا. ثانياً ، توقيت الهضم أمر بالغ الأهمية -كلاهما تحت - الهضم وأكثر من - الهضم يمكن أن يضر العائد على خلايا الكبد والقدرة على الجدوى. ثالثًا ، يجب أن تكون حالة الكبد مثالية ، حيث أن خلايا الكبد حساسة للغاية للأضرار الإقفارية. يجب تبريد الكبد المستخدم لإعداد خلايا الكبد بسرعة لتقليل معدلات التمثيل الغذائي ومنع نقص الأكسجة الأيضية ونقص التروية اللاحقة.

معايير الخلايا الكبدية الأولية المستخدمة في أبحاث الأدوية هي كما يلي:

1. 2. ثقافة الكبد 2D الأولية

نموذج التعليق الكبدي

أنه يحتوي على دواء كامل - إنزيمات استقلاب وعل العوامل المساعدة ، مما يجعله مناسبًا لدراسة مسارات التخليص الأيضية المختلفة. ومع ذلك ، فإن جدوى خلايا الكبد التعليق ونشاط المخدرات - استقلاب الإنزيمات تنخفض تدريجيا مع زيادة وقت الحضانة في المختبر ، مما يحد من وقت الحضانة بحد أقصى 4 ساعات. يستخدم هذا النموذج عادة لتقدير إزالة الأدوية بمعدلات خلوص معتدلة إلى عالية. عندما يكون معدل التخليص أقل من 20 ٪ ، لا يمكن تحديد قيم التخليص الدقيقة. تعتبر الكبد التقليدية - مقرها في نماذج التمثيل الغذائي في المختبر غير كافية لتوليد تفاعلات استقلابية قابلة للاكتشاف للمركبات البطيئة - استقلاب المركبات ، مما يحد من قدرتها على التنبؤ بمعدلات التخليص والمنتجات الأيضية لهذه المركبات. يمكن استخدام طريقة ترحيل خلايا الكبد (الشكل 1) لتمديد وقت الحضانة إلى 20 ساعة أو حتى أطول.

طلب:نشاط الإنزيم ودراسات الاستقرار الأيضي للأدوية الجزيئية الصغيرة.

الشكل 1.

المصدر: Metab Dispos ، 2012،40 (9): 1860-1865

نموذج الخلايا الكبدية القابلة للاتصال

تتم تربيتها الخلايا الكبدية الأولية في نظام ثنائي الأبعاد على الكولاجين - لوحات الثقافة المطلية. تظهر الخلايا الكبدية مورفولوجيا الظهارية ، مع نوى بارزة ، وغالبا ما تقدم في شكل نوكليت. تشمل عيوب ثقافة أحادي الطبقة الكبدية المفردة: 1. تغيير قطبية الخلية والوظيفة. عدم وجود أنواع خلايا أخرى ذات صلة (أي خلايا غير متني) مطلوبة للوظيفة الطبيعية. عدم القدرة على توفير ما يكفي من العناصر الغذائية وعوامل الباراكرين لدعم خلايا الكبد في أداء وظائفها (مثل التخليق الحيوي لأحماض الصفراء والبروتين المصل).

التطبيقات:

1). تقييم المخدرات - تفاعلات المخدرات:وهذا يشمل إنزيم تحريض ، تثبيط الإنزيم ، ودراسات الناقل. أولاً ، عندما يعمل الدواء كمحفز ، يمكن أن يؤدي إلى زيادة التعبير عن المخدرات - استقلاب الإنزيمات والناقلات. يمكن للمحفزات القوية تنظيم جينات متعددة في وقت واحد ، مثل التحريض الفينوباربيتال من CYP2B6 ، CYP3A4 ، CYP2C9 ، UGT ، والعديد من بروتينات النقل مثل MRP2. ثانياً ، هناك أنواع - اختلافات محددة في كيفية استجابة خلايا الكبد للمحفزات. على سبيل المثال ، Rifampicin هو محفز فعال لخلايا الكبد البشرية والأرانب ، ولكن ليس له تأثير تعريفي على خلايا الكبد الفئران. أخيرًا ، قد تؤدي كثافة الطلاء دون المستوى الأمثل للخلايا الكبدية القابلة للاتصال إلى انخفاض التعبير القاعدي عن P450s وزيادة الاستجابات التعريفية بشكل مصطنع. كما هو مبين في الشكل 3 ، تُظهر خلايا الكبد في كثافات الطلاء المنخفضة نشاطًا قاعديًا أقل من CYP1A2 و CYP2B6 و CYP3A4 ، ولكن الاستجابات التعريفية الأقوى. لذلك ، فإن الخلايا الكبدية الصحية في كثافة الطلاء المناسبة ضرورية للحصول على البيانات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.

الشكل 2. العلاقة بين كثافة الطلاء من خلايا الكبد البشرية المحفوظة بالتبريد وتحريض الإنزيم

المصدر: تقنيات اكتشاف الأدوية الحالية ، 2010 ، 7: 188 - 1988

2). تقييم تسمم الكبد: مراقبة التغيرات المورفولوجية تحت المجهر الضوئي ، مثل مورفولوجيا الخلايا ، وتجميع قطرات الدهون والدهون ، ومرفق الخلايا/الانفصال. الكشف عن نخر خلايا الكبد (كما هو موضح بواسطة الأسبارتات أمينوترانسفيراز ، ديهيدروجينيز اللاكتات ، والأمينين أمينوترانسفيراز) وموت الخلايا المبرمج (تجزئة الحمض النووي). بالنسبة إلى السيتوكين - السمية الخلوية بوساطة ، لا يمكن أن تتنبأ الثقافات أحادية الطبقة أحادي الطبقة من الخلايا الكبدية بالاستجابات السامة بسبب التنظيم من قبل المواد المنبعثة من الخلايا غير العاصفة المجاورة ، مثل خلايا Kupffer ، والخلايا النجمية ، والخلايا البطانية الجيبية.

3). "طريقة التتابع" لدراسة إزالة مركب الاستقلاب البطيء ومستقلباتها: نشاط الدواء - استقلاب الإنزيمات في الخلايا الكبدية القابلة للاتصال يبدأ في الانخفاض بعد 24 ساعة من الطلاء. بعد حضانة الخلايا الكبدية القابلة للاتصال مع المصل - وسط مجاني يحتوي على مركب الاهتمام لمدة 24 ساعة ، يتم جمع الوسيلة وخلطها ، ثم نقلها إلى خلايا الكبد الوهمية الجديدة لمزيد من الدراسة (الشكل 3).

الشكل 3.

المصدر: رسائل التمثيل الغذائي للمخدرات ، 2016 ، 10: 3 - 15

3). تقييم الامتصاص الخلوي ، والبطانة الداخلية ، والهروب الداخلي ، وآثار إسكات على الجين المستهدف لخلايا الكبد - الأدوية الحمضية النووية الصغيرة المستهدفة.

نموذج زراعة شطيرة

في المختبر ، يمكن تربية الخلايا الكبدية بين طبقتين من الكولاجين أو ماتريجل لإعادة بناء هياكل الجسم الحي ، والمعروفة باسم زراعة السندوتشات. الخلايا الكبدية المستزرعة بين طبقتين من الجل علاوة على ذلك ، يمكن لخلايا الكبد في ثقافة السندويش استعادة القطبية ، مما يسمح بالتوطين السليم للناقلين القاعديين والقناة ، وكذلك تكوين شبكات القناة الصفراوية الوظيفية (الشكل 4).

الشكل 4. التعبير المستقطب عن الناقلات في نموذج شطيرة الخلايا الكبدية البشرية

المصدر: تقنيات اكتشاف المخدرات الحالية ، 2010 ، 7 ، 188 - 1988

التطبيقات:

1. 1). تقدير إفراز الصفراوي للمركبات.
2. 2). تقييم التوزيع الكبدي والصفراوي للمركبات والمستقلبات الداخلية والخارجية.
3. 3). تقدير الخلوص بوساطة التمثيل الغذائي والناقلات ، وبناء فسيولوجيا - نماذج الدوائية القائمة على.
4. 4). دراسة السمية الكبدية وتوفير آليات للعقاقير السريرية - إصابة الكبد المستحثة. تم دمج البيانات في نماذج علم الصيدلة الأنظمة للتنبؤ بالمخدرات المحتملة - إصابة الكبد الناجمة في البشر.
5.  
   1. 3. ثقافة الكبد 3D الأولية

6. في أنظمة الثقافة ثلاثية الأبعاد ، يتم تربيتها في مصفوفة ثلاثية الأبعاد ، والتي تحاكي بشكل أفضل بنية الكبد في الجسم الحي مقارنةً بالثقافات أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد. تعزز هذه الأنظمة تفاعلات الخلية والخلايا - المصفوفة ، والتي يمكن أن تعيد المزيد من الوظائف الفسيولوجية للكبد ، بما في ذلك استقلاب الأدوية ، إفراز البروتين ، وتكوين الصفراء. يمكن استخدام الثقافات 3D لخلايا الكبد الأولية لدراسة الكبد - وظائف محددة في بيئة أكثر في الجسم الحي ، مما يوفر مزايا لاختبار المخدرات ، وتقييم السمية ، ونمذجة الأمراض.

   نموذج كروي

من خلال تقنيات مثل ثقافة المرفقات المنخفضة ، الثقافة المتدنية ، وثقافة الخلايا المغناطيسية (الشكل 5) ، يمكن أن تتجمع الخلايا الكبدية الأولية في الركام الكروي بقطر يصل إلى 150 - 175 ميكرومتر دون الاعتماد على المصفوفات الخارجية. تتمثل إحدى ميزة ثقافة الكروية في أن كل كروي لا يتطلب سوى 1330 - 2000 خلية ، مما يقلل بشكل كبير من عدد الخلايا مقارنة بتقنيات الثقافة ثلاثية الأبعاد الأخرى. أظهرت الدراسات الحديثة أن الثقافات الكروية الكبدية الأولية يمكن أن تحافظ عليها لمدة تصل إلى 5 أسابيع ، مع بقاء نشاط إنزيم CYP دون تغيير تقريبًا بين اليوم الثامن واليوم 35. وكشف تحليل البروتينات ، مقارنةً بثقافة السندوتشات ، والأنزيمات المسؤولة عن امتصاص المخدرات ، والتوزيع ، والتمثيل ، والتمرير ، محفوظات أفضل لمدة 14 يومًا في زراعة Spheroid. ومع ذلك ، فإن الكبد أكثر تعقيدًا من إجمالي الخلية. يتفاعل الجانب الجانبي للخلايا الكبدية مع الدم ، بينما يتدفق الصفراء من الجانب القمي ، وهو ميزة رئيسية لهيكل فصيص الكبد المعقد ، ولا يمكن تكرار ذلك في نموذج الكروي.

التطبيقات:

1. 1). دراسة عملية استقلاب البطيئة المركب ومستقلباتها.
2. 2). أبحاث السمية الكبدية.
3. 3). تقييم الامتصاص الخلوي ، والبطانة ، والهروب الإندوسومي ، وتأثيرات إسكات على الجينات المستهدفة من خلايا الكبد - الأدوية الحمضية النووية الصغيرة المستهدفة.

الشكل 5. طريقة ثقافة الكروية

نموذج الكبد العضوي

إن تعريف الإجماع للأعضاء هو: الهياكل ثلاثية الأبعاد المشتقة من الخلايا الجذعية ، أو الخلايا السلف ، أو الخلايا المتمايزة ، القادرة على استنساخ وظائف وهياكل بعض الأنسجة الأصلية في المختبر ، تحاكي بشكل فعال البيئة الدقيقة في الجسم الحي والخلايا - تم التعرف على الكبد العضوي كنموذج أكثر تطوراً لأبحاث بيولوجيا الكبد البشري.

مصادر الخلايا لبناء الكبد العضوي:

① الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSCs):

تمتلك الخلايا الجذعية الجنينية (ESCS) والخلايا الجذعية القادمة المستحثة (IPSCs) تعدد ، ولدونة ، وقدرة تكاثرية غير محدودة. تحت تأثير عوامل الإشارة المحددة ، فإنها تميز في خلايا الكبد - مثل الخلايا ذات النشاط والوظيفة. ومع ذلك ، قد تخضع عضلات الكبد المستمدة من PSCs إلى تغييرات جينية وراثي ، مع إظهار تغييرات غير مصممة كروموسومات أثناء التضخيم.

التطبيقات:

1. 1). نماذج أمراض الكبد الوراثية
2. 2). نماذج أمراض الكبد المعدية
3. 3). اختبار السمية الخلوية للمخدرات

② أنسجة الكبد - الخلايا المشتقة: وتشمل الخلايا الصفراوية وخلايا الكبد. تحتفظ خلايا الكبد الناضجة بإمكانية الخلايا الجذعية والقدرة التكاثرية في بيئات محددة. بالمقارنة مع psc - العضوية المشتقة ، تكون الأعضاء المستمدة من الأنسجة الأولية أكثر نضجا ، مع جينومات أكثر استقرارًا ، والحفاظ على الاستقرار المظهري والوراثي خلال مصطلح طويل في الثقافة المختبرية. ومع ذلك ، فإن القدرات التكاثرية الطويلة للتكاثري من خلايا الكبد البشرية الناضجة محدودة مقارنة بخلايا الكبد البشرية الجنينية أو خلايا الكبد الأولية للماوس البالغة. لا يزال زراعة عضلات كائنات الكبد الكبدية صعبة.

طريقة الثقافة (الشكل 6): يتم هضم أنسجة الكبد في خلايا واحدة ، ويتم زرع مزيج من matrigel والخلايا في لوحة بئر 24 - بئر لتشكيل هياكل على شكل قبة. حضانة في حاضنة ثقافة الخلية (37 درجة مئوية) لمدة 15 دقيقة. بعد التصلب ، أضف وسط ثقافة محددة. مرور بعد حوالي 14 يومًا. استبدل الوسيلة الأصلية بوسط التمايز بعد 7 - 10 أيام.

التطبيقات:

1. 1). نماذج تسمم الكبد
2. 2). في دراسات اضطراب التمثيل الغذائي في المختبر
3. 3). مرض الكبد الدهني غير الكحولي
4. 4). تطوير الأدوية لأمراض الكبد الحميدة والخبيثة

الشكل 6. الثقافة وعملية مرور الأنسجة

المصدر: الخلية والعلوم البيولوجية (2023) 13: 197

مقارنة بين ثقافة الكرات والثقافة العضوية

4.

1. 1. 2D Copatocyte Co - نموذج الثقافة
      

      في نموذج الثقافة الكبدي الأولي للكبد ، يتم خلط نوعين أو أكثر من أنواع الخلايا المختلفين ومثبتة في بيئة ثنائية الأبعاد. الميزة الرئيسية لهذا النموذج هي التفاعل المباشر بين أنواع الخلايا المختلفة ، والتفاعل بين الخلايا والمصفوفة خارج الخلية ، أو انتقال الإشارة غير المباشر عبر السيتوكينات والاتصالات الكيميائية. يمكن الحفاظ على وظائف خلايا الكبد الأولية ، مثل إنتاج الألبومين وإمكانية استقلاب الأدوية ، لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع.

      التطبيقات:

      1. 1). الخلايا الكبدية الأولية CO - مثقف مع الخلايا الليفية: يتم استخدام هذا النموذج لدراسة معدل التخليص من مركبات الاستقلاب البطيئة ومستقلباتها.
      2. 2). الخلايا الكبدية الأولية CO - مثقفة مع خلايا الكبد غير الممتدة (على سبيل المثال ، الخلايا النجمية ، الخلايا البطانية الجيبية): هذا النموذج مفيد للبحث
      3. 3). خلايا الكبد الأولية CO - مثقف مع الخلايا التائية: يستخدم هذا النموذج للكشف عن استقلاب أدوية الكبد - استجابات خلايا T محددة.
      4. 4). Iphase's Hepatomax ™نظام الثقافة CO - CONTRY: طور IPHASE نظامًا للثقافة مع خلايا الكبد الأولية من أنواع مختلفة ، والمعروفة باسم Hepatomax™. بواسطة CO - زراعة خلايا الكبد الأولية البشرية مع الخلايا اللحمية ، من الممكن الحفاظ على عقار جيد - استقلاب نشاط الإنزيم في خلايا الكبد البشرية لمدة تصل إلى 3 أسابيع. هذا النظام مناسب لدراسة معدلات إزالة المركب البطيئة - استقلاب مركبة ومستقلباتها.

      يوفر نموذج CO - Culture هذا منصة أكثر فسيولوجية ذات صلة من الناحية الفسيولوجية لتقييم استقلاب المخدرات والسمية والكبد - عمليات المرض ذات الصلة ، مما يوفر نظرة ثاقبة على كيفية مساهمة أنواع الخلايا المختلفة في وظيفة الكبد والمرض.
      
      

      3D COPATOCYTETE CO - نموذج الثقافة

      مباشرة 3D CO - الثقافة: يتضمن هذا النموذج خلط نوعين أو أكثر من خلايا الكبد (على سبيل المثال ، الخلايا الكبدية الأولية ، الخلايا البطانية الجيبية ، الخلايا النجمية الكبدية ، خلايا kupffer) لتشكيل الذات - المجمعة الكروية أو CO - تربيةها في بيئة ثلاثية الأبعاد مصممة مع مواد مثل الكولاجين ، الفيبرن ، الألغات ، أو الهيدروجينات. تتيح الثقافة ثلاثية الأبعاد المباشرة التفاعل الوثيق بين خلايا الكبد المختلفة من خلال آليات مثل الخلية - إلى - التصاق الخلية ، وإشارة الباراكرين عبر السيتوكينات القابلة للذوبان ، والتصاق المصفوفة خارج الخلية ، مما يتيح التواصل بين الخلايا الكبدية.

      التطبيقات:

      1. 1). نموذج تليف الكبد: يستخدم لدراسة آليات وتطور تليف الكبد.
      2. 2). المخدرات - نموذج إصابة الكبد الناجم عن (DILI): يساعد محاكاة وتقييم تلف الكبد الناتج عن الأدوية.
      3. 3). تفاعلات المخدرات ، استقلاب المخدرات ، وتحريض الإنزيم: يقيم كيفية تفاعل الأدوية المختلفة ، وكيفية استقلابها ، وكيف تحفز إنزيمات الكبد.

      غير مباشر 3D CO - الثقافة: تستخدم هذه الطريقة نظام فصل مادي (على سبيل المثال ، Transwell أو مواد أخرى) لثقافة نوعين أو أكثر من الخلايا (مثل الخلايا الكبدية الأولية مع خلايا NIH/3T3 أو الخلايا البطانية الجيبية) في بيئة ثلاثية الأبعاد ، حيث يتم منع الخلية المباشرة - إلى - تلامس الخلية. يحدث التواصل بين الخلايا عبر السيتوكينات القابلة للذوبان.

      التطبيقات:
      تستخدم لدراسة التواصل غير المتواصل بين خلايا الكبد في الجسم.

      
      باختصار ، يوفر Iphase ، كقائد في البحوث البيولوجية في المختبر ، حلولًا شاملة لاختبار الأدوية غير السريرية. من عزل وثقافة الخلايا الكبدية الأولية من الأنواع المختلفة إلى تطوير المنتجات الداعمة مثل وسائل الإعلام الثقافية لتطبيقات محددة أو الكولاجين المواصفات - المواصفات المغلفة ، يكرس iPhase لتقديم أفضل أدوات البحث في المختبر لاكتشاف الأدوية وتطويرها. نحن شريك موثوق به للعملاء في صناعة الأدوية ، ملتزمون بتوفير حلول القطع - الحافة للبحث السريري.