Как да подготвите слайдове за тест на кометата
TheКометен анализ, известен също като електрофореза с единичен - клетъчен гел, е чувствителна и универсална техника за количествено определяне на увреждането на ДНК в отделните клетки. Подготовка на високо - качествоСлайд за анализ на кометатаS е критична стъпка, която определя надеждността и възпроизводимостта на резултатите от анализа. Тази статия има за цел да предостави цялостно ръководство за подготовка на слайдове за анализ на Comet, интегриране на прозрения от експерти в тази област. Ще покрием всяка решаваща стъпка, от селекция на клетки до интерпретация на данни, като гарантираме, че постигате най -добрите възможни резултати.Въведение в теста на Comet и неговото значение
● Преглед на теста на Comet
Анализът на Comet, разработен в края на 80 -те години, е мощен инструмент за откриване на разкъсвания на ДНК нишки в отделни еукариотни клетки. Той се използва широко в области като тестване на генотоксичност, молекулярна епидемиология и биомониторинг на околната среда. Принципът на теста на кометата включва вграждане на клетки в агароза, лизирайки ги за отстраняване на мембрани и протеини и след това подлагане на ДНК на електрофореза. Полученото изображение, наподобяващо комета, позволява количественото определяне на увреждането на ДНК.● Приложения при откриване на увреждане на ДНК
Тестовете на кометата са особено ценни при откриване на увреждане на ДНК, причинени от токсини на околната среда, радиация и фармацевтични продукти. Те също играят съществена роля за оценка на ефикасността на механизмите за възстановяване на ДНК в различни типове клетки. Изследователите използват Comet тестове за изследване на рак, стареене и други заболявания, свързани с увреждане на ДНК.● Значение при тестване на генотоксичност
Регулаторната и изследователската значимост на анализите на Comet не може да бъде занижена. Те служат като основен предварителен скринингов инструмент за идентифициране на потенциални генотоксични съединения. Резултатите от тези анализи могат да повлияят на решението - Процеси в развитието на лекарствата и оценките на безопасността на околната среда.Избор на подходящи клетки за тест на кометата
● Използвани видове клетки
Изборът на клетки може значително да повлияе на резултата от тест на кометата. Често използваните клетки включват лимфоцити, букални клетки и различни култивирани клетъчни линии. Изследователите често избират типове клетки въз основа на целите на изследването и лекотата на получаване на проби.● Съображения за избор на клетки
Когато избирате клетки, помислете за фактори като наличност на клетките, чувствителност към увреждане на ДНК и значение за изследователския въпрос. Например, лимфоцитите се получават лесно от кръв и са чувствителни към генотоксични средства, което ги прави отличен избор за много проучвания.● Въздействие върху резултатите от анализа
Произходът и състоянието на клетките могат да повлияят на основното ниво на увреждане на ДНК и реакцията на клетката на лечението. Следователно, последователният подбор на клетките и обработката на протоколите са от решаващо значение за получаване на надеждни и възпроизводими резултати в тестовете на Comet.Приготвяне на агарозни гелове
● Видове агароза за използване
Изборът на правилната агароза е жизненоважен за целостта на теста на кометата. Предпочита се ниската точка на топене агарозата, тъй като се втвърдява бързо и свежда до минимум увреждането на ДНК по време на обработката. Препоръчва се високо - качествена агароза от реномирани доставчици, като тези от производителя на слайд за слайд на надежден кометен анализ или комета.● Агарозна концентрация и стъпки на подготовка
Обикновено се използва 1% ниска концентрация на агароза на топене. Разтворете агарозата в подходящ буфер, загрейте я, докато напълно се разтопи и след това се охладете до температура, която е безопасна за вграждане на клетките. Уверете се, че агарозата не е без мехурчета и отломки, за да избегнете артефакти в анализа.● Осигуряване на оптимално качество на гела
Качеството на агарозния гел може да повлияе на чувствителността и възпроизводимостта на анализа. Правилните техники за работа и подготовка са от съществено значение за производството на хомогенен гел с постоянни свойства в различни слайдове. Това гарантира, че образуването и визуализацията на кометите са еднакви.Клетъчна суспензия и вграждане на клетки в агароза
● Подготовка на клетъчната суспензия
Започнете с получаване на единична - клетъчна суспензия. За култивираните клетки това включва трипсинизация, последвано от неутрализация и промиване. За първични клетки като лимфоцити са необходими центрофугиране и ресуспендиране в подходящ буфер. Използвайте хемоцитометър, за да осигурите концентрация на клетки от приблизително 1 x 10^5 клетки/ml.● Вграждане на клетки в агароза с ниска топене на топене
Смесете клетъчната суспензия с предварително затоплена агароза на топене на ниска топене в съотношение, което осигурява равномерно разпределение на клетките. Бързо пипетирайте сместа върху слайдове за предварително покритие на кометата, които могат да бъдат закупени от фабрика за слайд на Comet или надежден доставчик. Използвайте покритие, за да разпространявате агарозата равномерно и предотвратявате въздушните мехурчета.● Разпространение на клетките върху слайдове
След като агарозата се разпространи, оставете слайдовете да се охладят и да се втвърдят върху студена повърхност или хладилна зона. Тази стъпка трябва да се извърши ефективно, за да се предотврати неравномерно настройката на агарозата, което може да повлияе на визуализацията на кометите по време на анализа.Лизис на клетки на слайдовете
● Състав на разтвора на лизис
Разтворът на лизис обикновено съдържа високи концентрации на соли и почистващи препарати, като NaCl, EDTA и Triton X - 100, за ефективно лизиране на клетките и премахване на мембраните и протеините, докато оставя ДНК непокътната.● Процедура и условия на лизис
Потапяйте слайдовете в разтвора на лизиса и се инкубирайте при 4 ° С в продължение на поне 1 час, въпреки че често се предпочита инкубацията за една нощ. Уверете се, че резервоарът за лизис е покрит, за да се избегне изпаряването и замърсяването. Условията на етапа на лизис са от решаващо значение за отстраняване на клетъчните съставки, без да се разграждат ДНК.● Значение на пълния клетъчен лизис
Непълният лизис може да доведе до лошо образуване на комета и ненадеждни данни. Следователно е от съществено значение да следвате внимателно протокола за лизис, като се гарантира, че разтворът прониква във всички части на слайда и че времената на инкубацията са достатъчни за цялостно прекъсване на клетките.Алкални условия на размотаване и електрофореза
● Подготовка на алкалния разтвор
Алкалният разтвор, често смес от NaOH и EDTA, се използва за размотаване на ДНК. Подготовката му трябва да се извърши внимателно, като се гарантира правилното рН и моларността. Прясно подгответе разтвора за поддържане на неговата ефикасност.● Алкално размотаване и време
Инкубират слайдове в алкалния разтвор, обикновено за 20 - 40 минути, за да позволят на ДНК нишките да се отпуснат. Тази стъпка е от решаващо значение за откриване на единични - прекъсвания на нишката и алкални - лабилни сайтове. Оптимизирайте времето за размотаване въз основа на вашия специфичен протокол и тип клетки.● Настройка и параметри на електрофореза
Настройте резервоара за електрофореза със студен буфер за електрофореза. Поставете слайдовете в резервоара, като се уверите, че те са напълно потопени. Нанесете последователно напрежение (обикновено около 25 V) за 20 - 30 минути. Условията на електрофорезата, включително напрежението и времето, трябва да бъдат оптимизирани, за да се постигне най -добрата разделителна способност на миграцията на ДНК.Процес на неутрализиране и оцветяване
● Подготовка и употреба на буфер за неутрализация
След електрофореза неутрализирайте слайдовете, за да спрете реакцията и стабилизирайте ДНК. Общият буфер за неутрализиране съдържа Tris основа при рН 7,5. Нежно изплакнете слайдовете в този буфер няколко пъти, за да премахнете всички следи от алкалния разтвор.● Техники за оцветяване
Оцветете неутрализираните слайдове с флуоресцентна ДНК - свързващо багрило, като етидиев бромид или Sybr Green. Етидиевият бромид, макар и класически, изисква внимателно боравене поради мутагенните си свойства. SYBR Green предлага по -безопасна алтернатива с висока чувствителност. Инкубирайте слайдовете в разтвора за оцветяване за подходящо време (обикновено 15 - 30 минути) на тъмно.● Визуализация на ДНК комети
След оцветяване изплакнете нежно слайдовете, за да премахнете излишното петно. Разгледайте слайдовете под флуоресцентен микроскоп. Качеството на оцветяването и разделителната способност на микроскопа са от решаващо значение за получаване на ясни изображения на кометите.Микроскопия и анализ на изображението
● Избор на правилния микроскоп
Флуоресцентен микроскоп, оборудван с подходящ филтър, е необходим за визуализиране на оцветена ДНК. Изберете микроскоп с висока разделителна способност и система за камера, способна да заснема подробни изображения на кометите.● Заснемане на високо - Качествени изображения
Заснемете изображения на поне 50 комети на слайд, за да осигурите статистическа значимост. Осигурете дори осветяване и фокусирайте, за да избегнете артефакти. Правилното калибриране на настройките на микроскопа и камерата може значително да подобри качеството на изображението.● Софтуер за анализ на кометата
Предлагат се няколко софтуерни програми за анализ на Comet, като CometScore и Casp. Тези програми измерват параметри като дължина на опашката, интензивност на опашката и момент на опашката, които са от решаващо значение за количествено определяне на увреждането на ДНК.Отстраняване на проблеми с често срещаните проблеми
● Чести проблеми
Честите проблеми в тестовете на Comet включват висока флуоресценция на фона, ниско образуване на комета и непоследователни резултати между слайдовете. Тези проблеми могат да произтичат от различни източници, включително лоша боравене с клетки, субоптимална подготовка на гел и неправилни условия на лизис или електрофореза.● Решения и превантивни мерки
За да се смекчи висока флуоресценция на фона, уверете се, че всички реагенти и гелове са без замърсители. За ниско образуване на комета проверете, че клетъчната жизнеспособност е висока, а условията на лизис са оптимални. Постоянната подготовка на слайда и задълбочено придържане на протокола са ключови превантивни мерки.● Осигуряване на възпроизводимост и точност
Постигането на възпроизводимост в тестовете на Comet изисква строга стандартизация на протокола и редовно валидиране на всяка стъпка. Редовно калибриране на оборудването, използвайте висококачествени реагенти и поддържайте подробни записи на всички експериментални условия, за да осигурите точност.Резултати от интерпретиране и отчитане на данни
● Анализ на параметрите на опашката на кометата
Ключовите параметри за количествено определяне на увреждането на ДНК включват дължина на опашката, която отразява степента на миграция на ДНК и интензивността на опашката, което обозначава количеството ДНК в опашката. Обикновено се използва и маслиновият момент, композитно измерване.● Статистически съображения в отчитането на данните
Точният статистически анализ е от съществено значение за интерпретацията на данните. Използвайте подходящи статистически тестове, за да сравните нивата на увреждане на ДНК между различните групи проби. Уверете се, че данните от множество слайдове и експерименти се обединяват, за да отчитат променливостта.● Представяне и тълкуване на констатациите
Представете резултатите си по ясен и кратък начин, като използвате графики и таблици, за да илюстрирате ключови констатации. Обсъдете последиците от наблюдаваните нива на увреждане на ДНК и потенциалното въздействие върху изследваната биологична система.Заключение: Постигане на висококачествени слайдове за анализ на кометата
Приготвянето на висококачествени слайдове за анализ на кометата включва внимателно разглеждане на селекцията на клетките, подготовката на агарозен гел, условията на лизис, електрофорезата, оцветяването и анализа на изображението. Всяка стъпка трябва да бъде щателно оптимизирана и стандартизирана, за да се осигурят надеждни и възпроизводими резултати. Сътрудничеството с реномирани доставчици и производители на тест за комета и производители може да подобри качеството на вашия анализ, като осигури висококачествени материали и техническа поддръжка.● заАфизенБиологични случаи
Със седалище в Северен Уелс, Пенсилвания, Айфазни биологични науки е „специализиран, нови и иновативни“ високи - технологични предприятия, интегриращи изследвания, разработки, производство, продажби и технически услуги на иновативни биологични реагенти. Използвайки обширни знания и страст към научните изследвания, нашият научен екип от повече от 50 опитни експерти се ангажира да предоставя качествени иновативни биологични реагенти на учени по целия свят и да помага на изследователите в своите научни начинания, за да помогнат за постигането на своите изследователски цели. Преследвайки идеала за научноизследователска и развойна дейност на „иновативни реагенти, изследване на бъдещето“, Iphase създаде множество съоръжения за научноизследователска и развойна дейност, центрове за продажби, складове и дистрибуторски партньори в Съединените щати, Европа и източноазиатските страни - обхващайки повече от 12 000 квадратни метра.Време за публикация: 2024 - 08 - 28 14:05:21