Cap pregunta

P: Com he de triar microsomes i hepatòcits per a estudis d’estabilitat metabòlica? Puc triar només un d’ells per complir el requisit?

R: En l’estudi d’estabilitat metabòlica, l’elecció de microsomes hepàtics o hepatòcits depèn principalment de les propietats metabòliques dels compostos, en què es tria la amb una elevada taxa metabòlica. En general, es prefereixen els microsomes hepàtics, sobretot quan les molècules compostes són més solubles i un metabolisme de fase és la principal via metabòlica (sobretot mitjançant CYP). Els hepatòcits es poden utilitzar per a experiments quan hi ha proves de dos metabolisme de fase - com a principal via, la hidròlisi com a via metabòlica principal, la unió de proteïnes altes inespecífiques en microsomes hepàtics i el metabolisme en els microsomes hepàtics no és evident. Normalment, es pot triar un sistema metabòlic per satisfer les necessitats; Si les condicions en tots els aspectes ho permeten, és millor triar els dos sistemes alhora.

P: Per què cal utilitzar hepatòcits primaris per a un assaig d’inducció enzimàtic?

R: L’enzim CYP - Assaig induït ha de passar de "transcripció", "traducció" a "Modificació de la proteïna" Post - Translacional per obtenir una proteïna enzimàtica CYP activa. Per tant, el sistema de prova ha de ser cèl·lules hepàtiques, no microsomes hepàtics o hepàtic S9.

P: Per què he de triar tres hepatòcits primaris humans donants per a l’assaig d’inducció d’enzims?

R: Segons la introducció a les directrius per a les interaccions del fàrmac, s’han d’utilitzar almenys tres donants i s’hauria d’avaluar el resultat d’inducció de cada donant per separat. A més de produir resultats estadísticament significatius, l’elecció de tres donants per a l’experiment també és més important per avaluar la variació individual. Si el resultat d'almenys un donant supera un llindar predeterminat, el candidat al fàrmac pot ser inductible i cal fer una avaluació de seguiment.

P: Per què centrar -se només en la inducció de l’enzim CYP i no en la inducció de l’enzim UGT?

R: El motiu per centrar -se en la inducció de la CYPase és que el mecanisme d’inducció de la CYPase s’ha estudiat amb més claredat. És a dir, el motiu de no requerir l’estudi de la inducció de la ugtase és que el mecanisme encara no està clar; Tot i això, això no significa que la ugtase no s’indueixi. Les directrius també afirmen que no hi ha cap sistema de classificació normalitzat per a inductors o inhibidors dels transportadors i enzims de metabolisme de la fase II.

P: Quant de temps poden sobreviure els hepatòcits primaris adherents després de la reanimació i quant de temps es poden mantenir els hepatòcits sense cultiu adherent després de la reanimació?

R: Els hepatòcits primaris pasteuritzats s’utilitzen generalment per a assajos d’inducció enzimàtics. Després de la recuperació cel·lular, les cèl·lules es suspenen en un medi de propagació de la placa, ajustats a la concentració adequada i es cultiven en plaques recobertes de col·lagen; llavors les cèl·lules es poden pasteuritzar en 4 ~ 6 hores. Després que les cèl·lules estiguin unides a la paret, el medi de manteniment es substitueix i es manté durant 18 h per assegurar la màxima restauració de l’estat cel·lular. A continuació, es pot realitzar un assaig d’inducció d’enzims per detectar l’activitat metabòlica i el nivell d’inducció d’ARNm. Des de la perspectiva de tot el cicle, els hepatòcits es poden mantenir durant 6 ~ 7 dies després de l’adherència de la paret. A mesura que passa el temps, l'estat de l'adherència de la paret cel·lular es deteriora i les cèl·lules es separaran i es suspendran.

Si els hepatòcits adherents no es cultiven, hem comprovat que es poden mantenir en un bon estat en unes 4 ~ 6 hores. Encara no hem realitzat verificació durant un període més llarg.

P: Els hepatòcits es poden utilitzar com a cèl·lules de suspensió i adherents segons els diferents medis de cultiu utilitzats?

R: La majoria de cèl·lules de teixits i òrgans sòlids estan emmurallats, però no totes les cèl·lules es murmuren quan es cultiven a - vitro. Si les cèl·lules són parets o no depèn de l’estat de les pròpies cèl·lules; Al mateix temps, les cèl·lules adherides de la paret necessiten un medi de cultiu específic i algunes substàncies especials d’adhesió a les cèl·lules (per exemple, Rhamnogelinogen, laminina, fibronectina, factor d’expansió sèrica) que poden participar en el procés de fixació cel·lular. En conclusió, les cèl·lules adherides es poden utilitzar com a cèl·lules de suspensió, però les cèl·lules de suspensió no estan necessàriament disponibles per a un ús adherent.

P: Quins són els avantatges/desavantatges de l'ús dels versos de la paret adherents a la suspensió dels hepatòcits? Quins són els criteris de decisió?

R: Després que els hepatòcits estiguin aïllats, es poden cultivar en suspensió o a la paret adherida. L’activitat de l’enzim del citocrom P450 dels hepatòcits primaris cultivats en suspensió és més coherent amb la de In - vivo durant els primers 4 ~ 6h, després disminueix ràpidament amb la prolongació del temps. Per tant, els hepatòcits de suspensió s’utilitzen generalment per a l’estudi d’estabilitat metabòlica o l’estudi de perfilació de metabòlits. Els hepatòcits primaris cultivats a la paret adherida tenen temps suficient per recuperar -se dels danys per mantenir les característiques biològiques i l’activitat metabòlica dels hepatòcits normals. Per tant, generalment s’utilitzen per a estudis d’inducció enzimàtics, estudis de citotoxicitat de fàrmacs, estabilitat metabòlica de fàrmacs metabolitzadors lents o estudis d’inferència del producte.

Actualment, no proporcionem un servei de compra en línia de la pàgina web. Els productes afegits al carretó de la compra després del registre i la sessió de sessió només són de referència. Si necessiteu comprar els nostres productes, deixeu la informació de contacte a través del canal de contacte i ens posarem en contacte amb vosaltres a temps per completar els nostres serveis.

P ： Com afecta la unió de proteïnes no específiques?

A ： Si el candidat al fàrmac s’uneix no - específicament a proteïnes microsòmiques, això es tradueix en paràmetres cinètics alterats. A mesura que la concentració de proteïnes augmenta, el valor KM augmenta, donant lloc a una presumpta presumpció intrínseca. Així mateix, la unió del medicament candidat a proteïnes en microsomes pot donar lloc a grans variacions en els resultats de diferents laboratoris i sistemes diferents.

Q ： La concentració recomanada de proteïna microsòmica hepàtica al manual d’instruccions del kit d’estabilitat metabòlica de la fase I o de la fase II és de 0,1 mg/ml - 1 mg/ml, vol dir que, quan s’utilitza microsomes hepàtics, encara cal diluir -los abans d’afegir -los al sistema?

A: No cal diluir primer els microsomes hepàtics; La concentració de microsomes hepàtics al kit és de 20 mg/ml i la concentració final de microsomes hepàtics al sistema de prova és de 0,1 - 1 mg/ml, cosa que es pot afegir proporcionalment.

P ： Quina és la densitat cel·lular recomanada per a les proves d’estabilitat metabòlica d’hepatòcits primaris? El càlcul de l’autorització és el mateix que per als microsomes hepàtics?

Un ： La densitat cel·lular recomanada per a l’assaig d’estabilitat metabòlica d’hepatòcits primaris és de 0,5 a 2 × 10⁶ Les cèl·lules/ml i els càlculs de liquidació i el processament dels resultats de l’assaig d’estabilitat metabòlica microsòmica hepàtica són consistents.

P ： Quins són els ingredients principals del vostre buffer PBS? Conta KCL i NACL?

A ： Els components principals del nostre buffer PBS són K₂HPO₄ i kh₂PO₄, i estan lliures de KCL i NACL.

P ： Quin és el propòsit dels buffers fosfats? Per què necessiteu fosfat?

Un ： Els tampons de fosfat s’escullen amb el seu propòsit de imitar l’entorn fisiològic, i el fosfat és una de les parelles tampó més importants per mantenir l’entorn fluid del cos.

P ： Quina és la configuració habitual per a la concentració del receptor induït per enzims? Hi ha alguna solució si la solubilitat del sistema a provar és pobra?

S'ha de configurar un assaig d'inducció de l'enzim amb 3 concentracions diferents, el nivell de concentració ha de cobrir la concentració efectiva de medicaments sanguinis previst en humans, i la concentració més alta és escollida com a mínim un ordre de magnitud superior a la concentració mitjana efectiva en sang en humans. Si la solubilitat en la fase aquosa és deficient, es pot triar un dissolvent orgànic com a dissolvent, per exemple. DMSO, però cal controlar la quantitat de dissolvent orgànic al sistema.

P ： En estudis d’estabilitat metabòlica, és necessari utilitzar dos sistemes de prova, microsomes hepàtics i hepatòcits primaris, per fer proves?

Les microsomes hepàtics són una vesícula de membrana gairebé esfèrica - Com les estructures formades per l’auto -fusió de reticle endoplasmàtic fragmentat obtinguts durant l’homogeneïtzació i la centrifugació diferencial dels teixits hepàtics i contenen enzims CYP450 i alguns enzims bifàsics, per exemple, UGTS, STS. Els hepatòcits primaris (PHC) són hepatòcits cultivats immediatament després de l’aïllament directe de les fetges animals, que bàsicament mantenen les funcions metabòliques del fetge, especialment conservant millor els nivells d’enzims consistents amb els in vivo. En l'estudi d'estabilitat metabòlica, no cal tenir en compte el cost i es poden seleccionar dos sistemes de prova per a la prova alhora; o el sistema de prova adequat es pot seleccionar segons les propietats metabòliques del compost, i el principi és el que té una taxa metabòlica elevada. En general, els microsomes hepàtics són la millor opció quan les molècules compostes són més solubles i un metabolisme de fase és la principal via metabòlica (especialment mitjançant CYP); Quan el metabolisme de la fase és la via principal, la hidròlisi és la principal via metabòlica, la unió de proteïnes no específiques en els microsomes hepàtics és molt elevat i el metabolisme no és evident en els microsomes hepàtics, la prova es pot dur a terme mitjançant hepatòcits primaris.

Q ： S’examina la concentració de microsomes a la prova d’estabilitat metabòlica? Quin és l'efecte de massa alt o massa baix?

A ： En la prova d’estabilitat metabòlica, la concentració de proteïnes també afectarà la taxa metabòlica, normalment triar la concentració de proteïnes microsòmiques de 0,1 mg/ml ~ 1 mg/ml, l’elecció específica de la quantitat de concentració de proteïnes s’ha de seleccionar segons les propietats metabòliques del compost. Una concentració massa alta de proteïna microsòmica comportarà una unió no específica del fàrmac a la proteïna microsòmica; Si bé una concentració massa baixa de proteïna microsòmica pot conduir a un metabolisme insignificant del fàrmac.