T: Bagaimana cara memilih mikrosom dan hepatosit untuk studi stabilitas metabolik? Bisakah saya memilih salah satu saja untuk memenuhi persyaratan?

J: Dalam studi stabilitas metabolik, pemilihan mikrosom hati atau hepatosit terutama bergantung pada sifat metabolik senyawa, dimana dipilih senyawa dengan laju metabolisme tinggi. Secara umum, mikrosom hati lebih disukai, terutama ketika molekul senyawa lebih larut dalam air dan metabolisme satu fase merupakan jalur metabolisme utama (terutama melalui CYP). Hepatosit dapat digunakan untuk percobaan bila terdapat bukti metabolisme dua fase sebagai jalur utama, hidrolisis sebagai jalur metabolisme utama, pengikatan protein nonspesifik yang tinggi pada mikrosom hati, dan metabolisme pada mikrosom hati tidak jelas. Biasanya, satu sistem metabolisme dapat dipilih untuk memenuhi kebutuhan; jika kondisi di semua aspek memungkinkan, yang terbaik adalah memilih kedua sistem secara bersamaan.

T: Mengapa perlu menggunakan hepatosit primer untuk uji induksi enzim?

J: Uji yang diinduksi enzim CYP-perlu beralih dari "Transkripsi", "Terjemahan" ke "Modifikasi protein pasca-translasi" untuk mendapatkan protein enzim CYP yang aktif. Oleh karena itu, sistem pengujiannya harus berupa sel hati, bukan mikrosom hati atau S9 hati.

T: Mengapa saya harus memilih tiga donor hepatosit primer manusia untuk uji induksi enzim?

J: Menurut Pengantar Pedoman Interaksi Obat, setidaknya tiga donor harus digunakan, dan hasil induksi masing-masing donor harus dievaluasi secara terpisah. Selain memberikan hasil yang signifikan secara statistik, pemilihan tiga donor untuk percobaan juga lebih penting untuk menilai variasi antar individu. Jika hasil dari setidaknya satu donor melebihi ambang batas yang telah ditentukan, kandidat obat mungkin dapat diinduksi dan diperlukan evaluasi lanjutan.

T: Mengapa fokus hanya pada induksi enzim CYP dan bukan pada induksi enzim UGT?

J: Alasan untuk fokus pada induksi CYPase adalah karena mekanisme induksi CYPase telah dipelajari dengan lebih jelas. Dengan kata lain, alasan tidak diperlukannya studi induksi UGTase adalah karena mekanismenya masih belum jelas; Namun, ini tidak berarti bahwa UGTase tidak akan terinduksi. Pedoman tersebut juga menyatakan bahwa tidak ada sistem klasifikasi standar untuk penginduksi atau penghambat transporter dan enzim metabolisme fase II.

T: Berapa lama hepatosit primer yang melekat dapat bertahan setelah resusitasi, dan berapa lama hepatosit dapat dipertahankan tanpa kultur yang melekat setelah resusitasi?

J: Hepatosit primer yang dipasteurisasi umumnya digunakan untuk pengujian induksi enzim. Setelah pemulihan sel, sel disuspensikan dalam media penyebaran pelat, disesuaikan dengan konsentrasi yang sesuai, dan dikultur dalam pelat berlapis kolagen-; kemudian sel dapat dipasteurisasi dalam waktu 4 ~ 6 jam. Setelah sel menempel pada dinding, media pemeliharaan diganti dan dipertahankan selama 18 jam untuk memastikan pemulihan keadaan sel secara maksimal. Selanjutnya, uji induksi enzim dapat dilakukan untuk mendeteksi aktivitas metabolisme dan tingkat induksi mRNA. Dari perspektif keseluruhan siklus, hepatosit dapat dipertahankan selama 6~7 hari setelah perlekatan dinding. Seiring berjalannya waktu, kondisi kepatuhan dinding sel memburuk, dan sel-sel akan terlepas dan tersuspensi.

Jika hepatosit yang melekat tidak dikultur, kami telah memverifikasi bahwa hepatosit tersebut dapat dipertahankan dalam kondisi baik dalam waktu 4~6 jam. Kami sudah lama tidak melakukan verifikasi.

T: Hepatosit dapat digunakan sebagai sel suspensi dan sel pengikat, bergantung pada media kultur berbeda yang digunakan?

A: Sebagian besar sel dari jaringan dan organ padat memiliki dinding, namun tidak semua sel memiliki dinding ketika dikultur secara in-vitro. Pelekat atau tidaknya sel pada dinding bergantung pada keadaan sel itu sendiri; pada saat yang sama, sel-sel yang menempel pada dinding memerlukan media kultur spesifik dan beberapa zat pro-sel adhesi khusus (misalnya rhamnogelinogen, laminin, fibronektin, faktor ekspansi serum) yang dapat berpartisipasi dalam proses perlekatan sel. Kesimpulannya, sel yang melekat dapat digunakan sebagai sel suspensi, namun sel suspensi belum tentu tersedia untuk digunakan sebagai sel yang melekat.

T: Apa keuntungan/kerugian menggunakan hepatosit suspensi ayat dinding yang melekat? Apa kriteria keputusannya?

A: Setelah hepatosit diisolasi, hepatosit dapat dibiakkan dalam suspensi atau pada dinding yang melekat. Aktivitas enzim sitokrom P450 dari suspensi hepatosit primer yang dikultur paling konsisten dengan aktivitas in -vivo selama 4~6 jam pertama, kemudian menurun dengan cepat seiring dengan bertambahnya waktu. Oleh karena itu, suspensi hepatosit umumnya digunakan untuk studi stabilitas metabolik atau studi profil metabolit. Hepatosit primer yang dikultur pada dinding yang melekat mempunyai waktu yang cukup untuk pulih dari kerusakan guna mempertahankan karakteristik biologis dan aktivitas metabolisme hepatosit normal. Oleh karena itu, mereka umumnya digunakan untuk studi induksi enzim, studi sitotoksisitas obat, stabilitas metabolik obat dengan metabolisme lambat atau studi inferensi produk.

Saat ini, kami tidak menyediakan layanan pembelian online halaman web. Produk yang ditambahkan ke keranjang belanja setelah registrasi dan login hanya untuk referensi. Jika Anda perlu membeli produk kami, silakan tinggalkan informasi kontak Anda melalui saluran Hubungi kami, dan kami akan menghubungi Anda tepat waktu untuk menyelesaikan layanan kami.

Q：Bagaimana pengikatan protein non-spesifik mempengaruhi hasil tes?

J：Jika kandidat obat berikatan secara non-spesifik dengan protein mikrosomal, hal ini menyebabkan perubahan parameter kinetik. Ketika konsentrasi protein meningkat, nilai Km meningkat, mengakibatkan perkiraan pembersihan intrinsik yang rendah. Selain itu, pengikatan kandidat obat ke protein dalam mikrosom dapat menghasilkan variasi hasil yang besar dari berbagai laboratorium dan sistem yang berbeda.

T：Konsentrasi protein mikrosomal hati yang direkomendasikan dalam buku petunjuk Kit Stabilitas Metabolik Fase I atau Fase II adalah 0,1 mg/mL-1 mg/mL, apakah ini berarti bahwa ketika menggunakan mikrosom hati, mikrosom hati masih perlu diencerkan dengan baik sebelum ditambahkan ke dalam sistem?

J: Mikrosom hati tidak perlu diencerkan terlebih dahulu; konsentrasi mikrosom hati dalam kit adalah 20 mg/mL dan konsentrasi akhir mikrosom hati dalam sistem pengujian adalah 0,1-1 mg/mL, yang dapat ditambahkan secara proporsional.

T：Berapa kepadatan sel yang direkomendasikan untuk pengujian stabilitas metabolik hepatosit primer? Apakah perhitungan klirensnya sama dengan perhitungan mikrosom hati?

J：Kepadatan sel yang direkomendasikan untuk uji stabilitas metabolisme hepatosit primer adalah 0,5 hingga 2×10⁶ sel/mL, dan penghitungan pembersihan serta pemrosesan hasil uji stabilitas metabolik mikrosomal hati konsisten.

Q：Apa bahan utama dalam buffer PBS Anda? Apakah mengandung KCl dan NaCl?

J:Komponen utama buffer PBS kami adalah K₂HPO₄ dan KH₂PO₄, dan bebas dari KCl dan NaCl.

T: Apa tujuan dari buffer fosfat? Mengapa Anda membutuhkan fosfat?

J: Buffer fosfat dipilih karena tujuannya meniru lingkungan fisiologis, dan fosfat adalah salah satu pasangan buffer terpenting untuk menjaga lingkungan cairan tubuh.

Q：Bagaimana pengaturan umum untuk konsentrasi reseptor yang diinduksi enzim? Apakah ada solusi jika kelarutan sistem yang akan diuji buruk?

J: Uji induksi enzim perlu diatur dengan 3 konsentrasi berbeda, tingkat konsentrasi harus mencakup konsentrasi obat darah efektif yang diharapkan pada manusia, dan konsentrasi tertinggi dipilih setidaknya satu tingkat lebih tinggi daripada rata-rata konsentrasi obat darah efektif pada manusia. Jika kelarutan dalam fase air buruk, pelarut organik dapat dipilih sebagai pelarutnya, misalnya. DMSO, namun jumlah pelarut organik yang ditambahkan ke sistem perlu dikontrol.

T: Dalam studi stabilitas metabolik, apakah perlu menggunakan dua sistem pengujian, mikrosom hati dan hepatosit primer, untuk pengujian?

J: Mikrosom hati adalah struktur mirip vesikel membran hampir bulat yang dibentuk oleh fusi mandiri retikulum endoplasma terfragmentasi yang diperoleh selama homogenisasi dan sentrifugasi diferensial jaringan hati, dan mengandung enzim CYP450 dan beberapa enzim bifasik, misalnya UGTs, STs. Hepatosit primer (PHC) adalah hepatosit yang dikultur segera setelah isolasi langsung dari hati hewan, yang pada dasarnya menjaga fungsi metabolisme hati, terutama menjaga tingkat enzim yang konsisten dengan yang in vivo dengan lebih baik. Dalam studi stabilitas metabolik, tidak perlu mempertimbangkan biaya, dan dua sistem pengujian dapat dipilih untuk pengujian pada saat yang bersamaan; atau sistem pengujian yang sesuai dapat dipilih sesuai dengan sifat metabolisme senyawa, dan prinsipnya adalah sistem mana yang memiliki laju metabolisme tinggi yang dipilih. Secara umum, mikrosom hati adalah pilihan terbaik ketika molekul senyawa lebih larut dalam air dan metabolisme satu fase merupakan jalur metabolisme utama (terutama melalui CYP); bila metabolisme dua fase merupakan jalur utama, hidrolisis merupakan jalur metabolisme utama, pengikatan protein non-spesifik pada mikrosom hati sangat tinggi, dan metabolisme pada mikrosom hati tidak terlihat jelas, maka pengujian dapat dilakukan dengan menggunakan hepatosit primer.

Q：Apakah konsentrasi mikrosom diperiksa pada uji stabilitas metabolik? Apa pengaruh terlalu tinggi atau terlalu rendah?

A：Dalam uji stabilitas metabolik, konsentrasi protein juga akan mempengaruhi laju metabolisme, biasanya pilih konsentrasi protein mikrosomal 0,1 mg/mL~1 mg/mL, pilihan spesifik berapa banyak konsentrasi protein harus dipilih sesuai dengan sifat metabolisme senyawa itu sendiri. Konsentrasi protein mikrosomal yang terlalu tinggi akan menyebabkan pengikatan obat yang tidak spesifik pada protein mikrosomal; sedangkan konsentrasi protein mikrosomal yang terlalu rendah dapat menyebabkan metabolisme obat yang tidak signifikan.