Otázka: Jak si mám vybrat mikrozomy a hepatocyty pro studie metabolické stability? Mohu si vybrat pouze jeden z nich, abych splnil požadavek?
Odpověď: Ve studii metabolické stability závisí výběr jaterních mikrozomů nebo hepatocytů hlavně na metabolických vlastnostech sloučenin, kde je zvolen ten s vysokou metabolickou rychlostí. Obecně jsou upřednostňovány jaterní mikrozomy, zejména pokud jsou molekuly sloučeniny více vody a jeden - fázový metabolismus je hlavní metabolická cesta (zejména prostřednictvím CYP). Hepatocyty mohou být použity pro experimenty, pokud existují důkazy dvou metabolismu - fáze jako hlavní cesty, hydrolýza jako hlavní metabolická cesta, vysoká nespecifická vazba proteinu v jaterních mikrozomech a metabolismus v jaterních mikrosomech není zřejmý. Obvykle může být jeden metabolický systém vybrán tak, aby vyhovoval potřebám; Pokud podmínky ve všech aspektech umožňují, je určitě nejlepší zvolit oba systémy současně.
Otázka: Proč je nutné použít primární hepatocyty pro test indukce enzymu?
Odpověď: Enzym CYP - Indukovaný test musí přejít z „transkripce“, „translace“ na „post - translační modifikace proteinu“, aby se získal aktivní enzymový protein CYP. Zkušebním systémem by proto měly být jaterní buňky, nikoli jaterní mikrozomy nebo jaterní S9.
Otázka: Proč si musím vybrat tři dárcovské primární hepatocyty pro test indukce enzymu?
Odpověď: Podle úvodu do pokynů pro lékové interakce by měly být použity nejméně tři dárci a výsledek indukce každého dárce by měl být vyhodnocen samostatně. Kromě vytváření statisticky významných výsledků je výběr tří dárců pro experiment také důležitější pro hodnocení inter - individuální variace. Pokud výsledek z alespoň jednoho dárce překročí předem stanovený práh, může být kandidát na léčivo vyvolatelný a je nutné následovat hodnocení UP.
Otázka: Proč se zaměřit pouze na indukci enzymu CYP a ne na indukci enzymu UGT?
Odpověď: Důvodem zaměření na indukci Cypázy je to, že mechanismus indukce Cypázy byl studován jasněji. Jinými slovy, důvodem, proč nevyžaduje studium indukce UGTázy, je to, že mechanismus je stále nejasný; To však neznamená, že UGTáza nebude vyvolána. Pokyny také uvádějí, že neexistuje standardizovaný klasifikační systém pro induktory nebo inhibitory transportérů a enzymů metabolismu fáze II.
Otázka: Jak dlouho mohou po resuscitaci přežít adherentní primární hepatocyty a jak dlouho mohou být hepatocyty udržovány bez adherentní kultury po resuscitaci?
Odpověď: Pasterizované primární hepatocyty se obecně používají pro testy indukce enzymů. Po zotavení buněk jsou buňky suspendovány v rozprostřeném médiu destiček, upraveny na vhodnou koncentraci a kultivovány v kolagenu potažených destičkách; Poté mohou být buňky pasterizovány do 4 ~ 6 hodin. Poté, co jsou buňky připojeny ke zdi, je údržbářské médium vyměněno a udržováno po dobu 18 hodin, aby se zajistilo maximální obnovení buněčného stavu. Dále lze provést test indukce enzymu pro detekci metabolické aktivity a hladiny indukce mRNA. Z pohledu celého cyklu mohou být hepatocyty udržovány po dobu 6 ~ 7 dnů po dodržování zdi. Postupem času se stav přilnavosti buněčné stěny zhoršuje a buňky se oddělí a zavěsují.
Pokud adherentní hepatocyty nejsou kultivovány, ověřili jsme, že mohou být udržovány v dobrém stavu do 4 ~ 6 hodin. Dosud jsme neprováděli ověření po delší dobu.
Otázka: Hepatocyty lze použít jako suspenzní i adherentní buňky v závislosti na různých použitých kultivačních médiích?
Odpověď: Většina buněk z pevných tkání a orgánů je zděná, ale ne všechny buňky jsou při kultivované vitro zděny. Zda jsou buňky zeď - adherentní nebo ne, závisí na samotném stavu buněk; Současně vyžadují stěny - adherentní buňky specifické kultivační médium a některé speciální pro - buněčné adhezní látky (např. Rhamnogelinogen, laminin, fibronektin, faktor expanze séra), které se mohou účastnit procesu připojení buněk. Závěrem lze říci, že adherentní buňky mohou být použity jako suspenzní buňky, ale suspenzní buňky nemusí být nutně k dispozici pro adherentní použití.
Otázka: Jaké jsou výhody/nevýhody používání adherentních veršů stěn zavěšení hepatocytů? Jaká jsou kritéria rozhodování?
Odpověď: Po izolaci hepatocytů mohou být kultivovány v suspenzi nebo v adherentní zdi. Aktivita enzymu cytochromu P450 z suspenzních kultivovaných primárních hepatocytů je nejvíce v souladu s aktivitou in - vivo pro první 4 ~ 6H, pak se rychle snižuje s prodloužením času. Hepatocyty suspenze se proto obecně používají pro studii metabolické stability nebo profilování metabolitu. Primární hepatocyty kultivované v adherentní stěně mají dostatek času na zotavení z poškození, aby se zachovala biologické vlastnosti a metabolickou aktivitu normálních hepatocytů. Proto se obecně používají pro studie indukce enzymů, studie cytotoxicity léčiva, metabolickou stabilitu pomalých metabolizačních léčiv nebo studie inferenčních produktů.
V současné době neposkytujeme webovou stránku online nákupní službu. Výrobky přidané do nákupního košíku po registraci a přihlášení jsou pouze pro informaci. Pokud potřebujete koupit naše produkty, zanechte prosím své kontaktní informace prostřednictvím kanálu Kontaktujte nás a my vás včas kontaktujeme, abychom dokončili naše služby.
Q ： Jak ovlivňuje výsledek testu non - specifická proteina?
A ： Pokud kandidát na léčivo váže ne - konkrétně na mikrosomální proteiny, to má za následek změněné kinetické parametry. Jak se koncentrace proteinu zvyšuje, zvyšuje se hodnota KM, což má za následek nízkou předpokládanou vnitřní clearance. Také vazba kandidáta léčiva na proteiny v mikrozomech může vést k velkým změnám výsledků různých laboratoří a různých systémů.
Q ： Doporučená koncentrace jaterního mikrozomálního proteinu v příručce pro metabolickou stabilitu fáze I nebo fáze II je 0,1 mg/ml - 1 mg/ml, znamená to, že při použití jaterních mikrozomů je stále nutné je zředit před jejich přidáním do systému?
A: Nejprve není třeba zředit jaterní mikrozomy; Koncentrace jaterních mikrozomů v soupravě je 20 mg/ml a konečná koncentrace jaterních mikrozomů v testovacím systému je 0,1 - 1 mg/ml, což lze přidat úměrně.
Otázka: Jaká je doporučená hustota buněk pro testování metabolické stability primárních hepatocytů? Je výpočet clearance stejný jako u jaterních mikrozomů?
A ： Doporučená hustota buněk pro primární test metabolické stability hepatocytů je 0,5 až 2 × 106 Buňky/ml a výpočty clearance a zpracování výsledků jaterního testu mikrosomální metabolické stability jsou konzistentní.
Q ： Jaké jsou hlavní složky v buffer PBS? Obsahuje KCl a NaCl?
A ： Hlavní komponenty našeho vyrovnávací paměti PBS jsou k2HPO4 a kh2PO4, a jsou bez KCL a NaCl.
Otázka: Jaký je účel fosfátových pufrů? Proč potřebujete fosfát?
A ： Fosfátové pufry jsou vybrány za účelem napodobování fyziologického prostředí a fosfát je jedním z nejdůležitějších párů pufru pro udržení tekutého prostředí těla.
Q ： Jaké je obvyklé nastavení pro enzym - koncentrace receptoru indukované? Existuje nějaké řešení, pokud je rozpustnost testovaného systému špatná?
A ： Enzymový indukční test musí být nastaven se 3 různými koncentracemi, úroveň koncentrace musí pokrýt očekávanou účinnou koncentraci krevního léčiva u lidí a nejvyšší koncentrace je vybrána tak, aby byla alespoň o jeden řád vyšší než průměrná účinná koncentrace krevního léčiva u lidí. Pokud je rozpustnost ve vodné fázi špatná, lze jako rozpouštědlo vybrat organické rozpouštědlo, např. DMSO, ale množství organického rozpouštědla přidaného do systému je třeba ovládat.
Otázka: Ve studiích metabolické stability je nutné použít pro testování dva testovací systémy, jaterní mikrozomy a primární hepatocyty?
A jaterní mikrozomy jsou téměř sférické membránové vezikuly - jako struktury tvořené vlastní fúzí fragmentovaného endoplazmatického retikula získaného během homogenizace a diferenciální centrifugace jaterních tkání a obsahují enzymy CYP450 a enzymy CYP450 a ugs, Ugts. Primární hepatocyty (PHC) jsou hepatocyty kultivované bezprostředně po přímé izolaci ze zvířecích játra, které v podstatě udržují metabolické funkce játra, zejména lépe zachovávají hladiny enzymu v souladu s funkcemi in vivo. Ve studii metabolické stability není třeba zvážit náklady a pro test lze vybrat dva testovací systémy současně; nebo lze vybrat příslušný testovací systém podle metabolických vlastností sloučeniny a princip je ten, který má systém vysokou metabolickou rychlost. Obecně jsou jaterní mikrozomy nejlepší volbou, když jsou molekuly sloučeniny více rozpustné a jeden - fázový metabolismus je hlavní metabolická cesta (zejména prostřednictvím CYP); Když je hlavní cestou dvou - fázového metabolismu, hydrolýza je hlavní metabolickou cestou, vazba proteinu v jaterních mikrozomech je velmi vysoká a metabolismus není v jaterních mikrozomech zřejmý, test lze provádět pomocí primárních hepatocytů.
Q ： Je koncentrace mikrozomů zkoumána v testu metabolické stability? Jaký je účinek příliš vysokého nebo příliš nízkého?
： Při testu metabolické stability bude koncentrace proteinu také ovlivnit rychlost metabolismu, obvykle zvolí koncentraci mikrosomálního proteinu 0,1 mg/ml ~ 1 mg/ml, specifická volba, jak by měla být vybrána podle vlastních metabolických vlastností sloučeniny. Příliš vysoká koncentrace mikrosomálního proteinu povede k ne -specifické vazbě léčiva na mikrosomální protein; Zatímco příliš nízká koncentrace mikrosomálního proteinu může vést k nevýznamnému metabolismu léčiva.