FAQ

Spørgsmål: Hvordan skal jeg vælge mikrosomer og hepatocytter til metaboliske stabilitetsundersøgelser? Kan jeg kun vælge en af ​​dem for at opfylde kravet?

A: I metabolisk stabilitetsundersøgelse afhænger valget af levermikrosomer eller hepatocytter hovedsageligt af forbindelsens metaboliske egenskaber, hvor den med en høj metabolisk hastighed vælges. Generelt foretrækkes levermikrosomer, især når forbindelsesmolekylerne er mere vand - opløseligt og en - fasemetabolisme er den vigtigste metaboliske vej (især via CYP). Hepatocytter kan anvendes til eksperimenter, når der er tegn på to - fasemetabolisme som den vigtigste vej, hydrolyse som den vigtigste metaboliske vej, høj ikke -specifik proteinbinding i levermikrosomer og metabolisme i levermikrosomer er ikke tydelige. Normalt kan et metabolisk system vælges til at imødekomme behovene; Hvis betingelserne i alle aspekter tillader det, er det bestemt bedst at vælge begge systemer på samme tid.

Spørgsmål: Hvorfor er det nødvendigt at bruge primære hepatocytter til enzyminduktionsassay?

A: CYP -enzym - induceret assay skal gå fra "transkription", "oversættelse" til "post - translationel modifikation af protein" for at opnå et aktivt CYP -enzymprotein. Derfor skal testsystemet være leverceller, ikke levermikrosomer eller lever S9.

Spørgsmål: Hvorfor skal jeg vælge tre donor humane primære hepatocytter til enzyminduktionsassay?

A: I henhold til introduktionen til retningslinjerne for lægemiddelinteraktioner skal mindst tre donorer bruges, og induktionsresultatet af hver donor skal evalueres separat. Ud over at producere statistisk signifikante resultater er valget af tre donorer til eksperimentet også vigtigere til vurdering af inter - individuel variation. Hvis resultatet fra mindst en donor overstiger en forudbestemt tærskel, kan lægemiddelkandidaten være inducerbar, og der kræves evaluering af evaluering.

Spørgsmål: Hvorfor kun fokusere på CYP -enzyminduktion og ikke på UGT -enzyminduktion?

A: Årsagen til at fokusere på cypase -induktion er, at mekanismen for cypase -induktion er blevet undersøgt mere tydeligt. Med andre ord er grunden til ikke at kræve undersøgelse af UGTase -induktion, at mekanismen stadig er uklar; Dette betyder dog ikke, at UGTase ikke vil blive induceret. Retningslinjerne angiver også, at der ikke er noget standardiseret klassificeringssystem for inducere eller hæmmere af transportører og fase II metabolisme enzymer.

Spørgsmål: Hvor længe kan vedhæftning af primære hepatocytter overleve efter genoplivning, og hvor længe kan hepatocytter opretholdes uden vedhæftningskultur efter genoplivning?

A: Pasteuriserede primære hepatocytter anvendes generelt til enzyminduktionsassays. Efter celleindvinding suspenderes celler i pladespredningsmedium, justeres til passende koncentration og dyrkes i kollagen - coatede plader; Derefter kan celler pasteuriseres inden for 4 ~ 6 timer. Når cellerne er fastgjort til væggen, udskiftes og vedligeholdes vedligeholdelsesmediet i 18 timer for at sikre maksimal restaurering af celletilstand. Dernæst kan enzyminduktionsassay udføres for at detektere metabolisk aktivitet og mRNA -induktionsniveau. Fra perspektivet af hele cyklussen kan hepatocytter opretholdes i 6 ~ 7 dage efter vægadhæsion. Efterhånden som tiden går, forværres cellevæggenescenens tilstand, og cellerne vil løsne og suspendere.

Hvis de vedhæftede hepatocytter ikke dyrkes, har vi verificeret, at de kan opretholdes i en god tilstand inden for 4 ~ 6 timer. Vi har endnu ikke foretaget verifikation i en længere periode.

Spørgsmål: Hepatocytter kan bruges som både suspension og vedhæftede celler afhængigt af de forskellige anvendte kulturmedier?

A: De fleste celler fra faste væv og organer er vægge, men ikke alle celler er vægge, når de dyrkes i - vitro. Om cellerne er væg - vedhæftende eller ikke afhænger af cellernes tilstand; På samme tid har væg - adhærente celler brug for specifikt kulturmedium og nogle specielle pro - celleadhæsionsstoffer (f.eks. Rhamnogelinogen, laminin, fibronectin, serumudvidelsesfaktor), som kan deltage i processen med cellefasthed. Afslutningsvis kan adhærerende celler anvendes som ophængceller, men ophængsceller er ikke nødvendigvis tilgængelige til vedhæftende brug.

Spørgsmål: Hvad er fordelene/ulemperne ved at bruge vedhæftede væg vers ophæng hepatocytter? Hvad er beslutningskriterierne?

A: Når hepatocytter er isoleret, kan de dyrkes i suspension eller i vedhæftningsmur. Aktiviteten af ​​cytochrome P450 -enzym fra suspensionskulturerede primære hepatocytter er mest konsistent med aktiviteten i - vivo for de første 4 ~ 6H, og falder derefter hurtigt med forlængelsen af ​​tiden. Derfor anvendes suspensionshepatocytter generelt til metabolisk stabilitetsundersøgelse eller metabolitprofileringsundersøgelse. Primære hepatocytter, der er dyrket i vedhæftede væg, har tilstrækkelig tid til at komme sig efter skader til at opretholde de biologiske egenskaber og metaboliske aktiviteter af normale hepatocytter. Derfor anvendes de generelt til enzyminduktionsundersøgelser, medikamentcytotoksicitetsundersøgelser, metabolisk stabilitet af langsom metaboliserende medikamenter eller produktinferencesundersøgelser.

I øjeblikket leverer vi ikke webside online købstjeneste. De produkter, der er føjet til indkøbskurven efter registrering og login, er kun til reference. Hvis du har brug for at købe vores produkter, skal du forlade dine kontaktoplysninger via Contact Us -kanalen, og vi vil kontakte dig i tide for at afslutte vores tjenester.

Q ： Hvordan påvirker ikke -specifik proteinbinding testresultater?

A ： Hvis lægemiddelkandidaten binder ikke - specifikt til mikrosomale proteiner, resulterer dette i ændrede kinetiske parametre. Efterhånden som proteinkoncentrationen øges, øges KM -værdien, hvilket resulterer i en lav formodet iboende clearance. Bindingen af ​​lægemiddelkandidaten til proteiner i mikrosomer kan også resultere i store variationer i resultater fra forskellige laboratorier og forskellige systemer.

Q ： Den anbefalede koncentration af levermikrosomalt protein i brugsanvisningen til fase I eller fase II metabolisk stabilitetssæt er 0,1 mg/ml - 1 mg/ml, betyder det, at når man bruger levermikrosomer, er det stadig nødvendigt at fortynde dem godt, før de tilføjer dem til systemet?

EN: Det er ikke nødvendigt at fortynde levermikrosomerne først; Koncentrationen af ​​levermikrosomer i kittet er 20 mg/ml, og den endelige koncentration af levermikrosomer i testsystemet er 0,1 - 1 mg/ml, hvilket kan tilsættes proportionalt.

Q ： Hvad er den anbefalede celletæthed til metabolisk stabilitetstest af primære hepatocytter? Er beregningen af ​​godkendelsen den samme som for levermikrosomer?

A ： Den anbefalede celletæthed for den primære hepatocytmetaboliske stabilitetsassay er 0,5 til 2 × 10⁶ Celler/ml, og clearance -beregningerne og behandlingen af ​​resultaterne af levermikrosomal metabolisk stabilitetsassay er konsistente.

Q ： Hvad er de vigtigste ingredienser i din PBS -puffer? Indeholder det KCL og NaCl?

A ： Hovedkomponenterne i vores PBS -buffer er k₂HPO₄ og kh₂PO₄, og er fri for KCL og NaCl.

Q ： Hvad er formålet med fosfatbuffere? Hvorfor har du brug for fosfat?

A ： Fosfatbuffere vælges med henblik på at efterligne det fysiologiske miljø, og fosfat er et af de vigtigste bufferpar til at opretholde kroppens flydende miljø.

Q ： Hvad er den sædvanlige indstilling for enzym - induceret receptorkoncentration? Er der nogen løsning, hvis opløseligheden af ​​systemet, der skal testes, er dårlig?

A ： Enzyminduktionsassayet skal indstilles med 3 forskellige koncentrationer, koncentrationsniveauet skal dække den forventede effektive blodlægemiddelkoncentration hos mennesker, og den højeste koncentration vælges til at være mindst en størrelsesorden, der er højere end den gennemsnitlige effektive blodkoncentration af blodmedicin hos mennesker. Hvis opløseligheden i den vandige fase er dårlig, kan et organisk opløsningsmiddel vælges som dets opløsningsmiddel, f.eks. DMSO, men mængden af ​​organisk opløsningsmiddel tilsat systemet skal kontrolleres.

Q ： I metaboliske stabilitetsundersøgelser er det nødvendigt at bruge to testsystemer, levermikrosomer og primære hepatocytter til test?

A ： Levermikrosomer er næsten sfæriske membranvesikel - Lignende strukturer dannet af selvet - Fusion af fragmenterede endoplasmatiske retikulum opnået under homogenisering og differentiel centrifugering af levervæv og indeholder CYP450 -enzymer og nogle biphasiske enzymes, f.eks. UGTS, STS. Primære hepatocytter (PHC'er) er hepatocytter dyrket umiddelbart efter direkte isolering fra dyrelever, som dybest set opretholder de metaboliske funktioner i leveren, især bedre at bevare enzymniveauerne, der er i overensstemmelse med dem in vivo. I den metaboliske stabilitetsundersøgelse er der ingen grund til at overveje omkostningerne, og to testsystemer kan vælges til testen på samme tid; Eller det passende testsystem kan vælges i henhold til forbindelsens metaboliske egenskaber, og princippet er, at hvilket system har en høj metabolisk hastighed, der vælges. Generelt er levermikrosomer det bedste valg, når forbindelsesmolekylerne er mere vand - opløselige og en - fasemetabolisme er den vigtigste metaboliske vej (især via CYP); Når to - fasemetabolisme er hovedvejen, er hydrolyse den vigtigste metaboliske vej, ikke - specifik proteinbinding i levermikrosomerne er meget høj, og metabolismen er ikke åbenlyst i levermikrosomerne, testen kan udføres ved hjælp af primære hepatocytter.

Q ： Er koncentrationen af ​​mikrosomer undersøgt i den metaboliske stabilitetstest? Hvad er effekten af ​​for høj eller for lav?

A ： I den metaboliske stabilitetstest vil proteinkoncentrationen også påvirke den metaboliske hastighed, som normalt vælger den mikrosomale proteinkoncentration på 0,1 mg/ml ~ 1 mg/ml, det specifikke valg af, hvor meget proteinkoncentration der skal vælges i henhold til sammensætningsens egne metaboliske egenskaber. For høj koncentration af mikrosomalt protein vil føre til ikke - specifik binding af lægemidlet til det mikrosomale protein; Mens for lav koncentration af mikrosomalt protein kan føre til ubetydelig metabolisme af lægemidlet.