FAQ

F: Wie sollte ich Mikrosomen und Hepatozyten für Studien zur Stoffwechselstabilität auswählen? Kann ich nur einen von ihnen auswählen, um die Anforderung zu erfüllen?

A: In der Studie zur Stoffwechselstabilität hängt die Auswahl von Lebermikrosomen oder Hepatozyten hauptsächlich von den Stoffwechseleigenschaften der Verbindungen ab, wobei die mit einer hohen Stoffwechselrate gewählt wird. Im Allgemeinen werden Lebermikrosomen bevorzugt, insbesondere wenn die zusammengesetzten Moleküle mehr Wasser löslich sind und ein Phasenstoffwechsel der Hauptstoffwechselweg ist (insbesondere über CYP). Hepatozyten können für Experimente verwendet werden, wenn zwei - Phasenstoffwechsel als Hauptweg, Hydrolyse als Hauptstoffwegen, hohe unspezifische Proteinbindung in Lebermikrosomen und der Stoffwechsel in Lebermikrosomen vorhanden sind. Normalerweise kann ein Stoffwechselsystem ausgewählt werden, um die Bedürfnisse zu erfüllen. Wenn die Bedingungen in allen Aspekten dies zulassen, ist es definitiv am besten, beide Systeme gleichzeitig zu wählen.

F: Warum ist es notwendig, primäre Hepatozyten für den Enzyminduktionsassay zu verwenden?

A: CYP -Enzym - Induzierter Assay muss von "Transkription", "Translation" zu "Post - Translationsmodifikation von Protein" wechseln, um ein aktives CYP -Enzymprotein zu erhalten. Daher sollte das Testsystem Leberzellen sein, nicht Lebermikrosomen oder Leber S9.

F: Warum muss ich drei humane primäre Hepatozyten des Spenders für den Enzyminduktionsassay wählen?

A: Nach Einführung der Richtlinien für Arzneimittelwechselwirkungen sollten mindestens drei Spender verwendet werden, und das Induktionsergebnis jedes Spenders sollte separat bewertet werden. Neben der Erzeugung statistisch signifikanter Ergebnisse ist die Auswahl von drei Spendern für das Experiment auch wichtiger für die Beurteilung der internen Variation. Wenn das Ergebnis von mindestens einem Spender einen vorgegebenen Schwellenwert überschreitet, kann der Arzneimittelkandidat induzierbar sein und eine Bewertung der Bewertung erforderlich sein.

F: Warum sich nur auf die CYP -Enzyminduktion und nicht auf die UGT -Enzyminduktion konzentrieren?

A: Der Grund für die Konzentration auf die Cypase -Induktion ist, dass der Mechanismus der Cypase -Induktion deutlicher untersucht wurde. Mit anderen Worten, der Grund dafür, dass der Untersuchung der UGTase -Induktion nicht erforderlich ist, ist, dass der Mechanismus noch unklar ist. Dies bedeutet jedoch nicht, dass UGTase nicht induziert wird. In den Richtlinien gibt es auch, dass es kein standardisiertes Klassifizierungssystem für Induktoren oder Inhibitoren von Transportern und Phase -II -Metabolismus -Enzymen gibt.

F: Wie lange können anhaftende primäre Hepatozyten nach der Wiederbelebung überleben und wie lange können Hepatozyten nach der Wiederbelebung ohne anhaftende Kultur aufrechterhalten werden?

A: Pasteurisierte primäre Hepatozyten werden im Allgemeinen für Enzyminduktionsassays verwendet. Nach der Erholung der Zellen werden die Zellen in Plattenverteilungsmedium suspendiert, an eine angemessene Konzentration eingestellt und in kollagenbeschichteten Platten kultiviert. Dann können Zellen innerhalb von 4 ~ 6 Stunden pasteurisiert werden. Nachdem die Zellen an der Wand befestigt sind, wird das Wartungsmedium 18 Stunden lang ersetzt und gehalten, um die maximale Wiederherstellung des Zellzustands zu gewährleisten. Als nächstes kann der Enzyminduktionsassay durchgeführt werden, um die Stoffwechselaktivität und das mRNA -Induktionsniveau nachzuweisen. Aus der Perspektive des gesamten Zyklus können Hepatozyten 6 bis 7 Tage nach der Wandeinhaltung aufrechterhalten werden. Mit der Zeit verschlechtert sich der Zellwandverhaltenszustand, und die Zellen lösen und suspendieren.

Wenn die anhaftenden Hepatozyten nicht kultiviert werden, haben wir überprüft, ob sie innerhalb von 4 bis 6 Stunden in einem guten Zustand aufrechterhalten werden können. Wir haben noch länger keine Überprüfung durchgeführt.

F: Hepatozyten können je nach den verschiedenen verwendeten Kulturmedien sowohl als Suspension als auch als anhaftende Zellen verwendet werden?

A: Die meisten Zellen aus festen Geweben und Organen werden ummauert, aber nicht alle Zellen werden in - vitro kultiviert. Ob die Zellen die Wand sind, hängt von dem Zustand der Zellen selbst an; Gleichzeitig benötigen adhärente Zellen ein spezifisches Kulturmedium und einige spezielle Pro -- -Zelladhäsionssubstanzen (z. B. Rhamnogelinogen, Laminin, Fibronektin, Serumerweiterungsfaktor), die am Prozess der Zellanhaftung teilnehmen können. Zusammenfassend können anhaftende Zellen als Suspensionszellen verwendet werden, aber Suspensionszellen sind nicht unbedingt für die anhaltende Verwendung verfügbar.

F: Was sind die Vor-/Nachteile bei der Verwendung an anhaftender Hepatozyten für Wandverse? Was sind die Entscheidungskriterien?

A: Nachdem Hepatozyten isoliert sind, können sie in Suspension oder in anhaftender Wand kultiviert werden. Die Aktivität des Cytochrom -P450 -Enzyms aus der Suspension kultivierten primären Hepatozyten stimmt am meisten mit der von in - vivo für die ersten 4 ~ 6 Stunden überein und nimmt dann mit der Verlängerung der Zeit schnell ab. Daher werden Hepatozyten der Suspension im Allgemeinen für die Studie zur Stoffwechselstabilität oder für die Metabolitenprofilierungsstudie verwendet. Primäre Hepatozyten, die in anhaftender Wand kultiviert wurden, haben eine ausreichende Zeit, um sich von Schäden zu erholen, um die biologischen Eigenschaften und die Stoffwechselaktivität normaler Hepatozyten aufrechtzuerhalten. Daher werden sie im Allgemeinen für Enzyminduktionsstudien, Studien mit Arzneimittelzytotoxizität, metabolische Stabilität langsamer metabolisierender Arzneimittel oder Produktinferenzstudien verwendet.

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F: Wie wirkt sich die nicht - spezifische Proteinbindung auf die Testergebnisse aus?

A: Wenn der Arzneimittelkandidat nicht - spezifisch an mikrosomale Proteine ​​bindet, führt dies zu veränderten kinetischen Parametern. Mit zunehmender Proteinkonzentration nimmt der KM -Wert zu, was zu einer niedrigen vermuteten intrinsischen Clearance führt. Auch die Bindung des Arzneimittelkandidaten an Proteine ​​in Mikrosomen kann zu großen Unterschieden in Ergebnissen verschiedener Laboratorien und verschiedener Systeme führen.

F: Die empfohlene Konzentration des mikrosomalen Leber -Proteins in der Bedienungsanleitung des Stoffwechselkits der Phase I oder des Phase -II -Kits beträgt 0,1 mg/ml - 1 mg/ml. Bedeutet dies, dass bei Verwendung von Lebermikrosomen sie noch gut verdünnt werden müssen, bevor Sie sie dem System hinzufügen?

A: Es besteht keine Notwendigkeit, zuerst die Lebermikrosomen zu verdünnen. Die Konzentration der Lebermikrosomen im Kit beträgt 20 mg/ml und die Endkonzentration von Lebermikrosomen im Testsystem beträgt 0,1 - 1 mg/ml, was proportional zugesetzt werden kann.

F: Was ist die empfohlene Zelldichte für die metabolische Stabilitätstests von primären Hepatozyten? Ist die Clearance -Berechnung die gleiche wie bei Lebermikrosomen?

A: Die empfohlene Zelldichte für den primären Hepatozyten -Stoffwechsel -Assay beträgt 0,5 bis 2 × 10⁶ Zellen/ml und die Clearance -Berechnungen und die Verarbeitung der Ergebnisse des Lebermetabolstabilitätstests sind konsistent.

F: Was sind die Hauptbestandteile in Ihrem PBS -Puffer? Enthält es KCL und NaCl?

A: Die Hauptkomponenten unseres PBS -Puffer sind K.₂HPO₄ und kh₂PO₄, und sind frei von KCL und NaCl.

F: Was ist der Zweck von Phosphatpuffern? Warum brauchst du Phosphat?

A: Phosphatpuffer werden ausgewählt, um die physiologische Umgebung nachzuahmen, und Phosphat ist eines der wichtigsten Pufferpaare für die Aufrechterhaltung der Flüssigkeitsumgebung des Körpers.

F: Was ist die übliche Kulisse für die Enzym -induzierte Rezeptorkonzentration? Gibt es eine Lösung, wenn die zu testende Löslichkeit des Systems schlecht ist?

A: Der Enzyminduktionsassay muss mit 3 verschiedenen Konzentrationen eingerichtet werden, der Konzentrationsspiegel muss die erwartete wirksame Blutmedikamentenkonzentration beim Menschen abdecken, und die höchste Konzentration wird als mindestens eine Größenordnung höher als die durchschnittliche wirksame Blutmedikamentenkonzentration beim Menschen ausgewählt. Wenn die Löslichkeit in der wässrigen Phase schlecht ist, kann ein organisches Lösungsmittel als Lösungsmittel ausgewählt werden, z. DMSO, aber die Menge an organischen Lösungsmitteln, die dem System hinzugefügt werden, muss gesteuert werden.

F ： In metabolischen Stabilitätsstudien müssen zwei Testsysteme, Lebermikrosomen und primäre Hepatozyten zum Testen verwendet werden?

A: hepatische Mikrosomen sind fast kugelförmige Membranvesikel - wie Strukturen, die durch das Selbstfusion von fragmentierten endoplasmatischen Retikulum gebildet werden, die während der Homogenisierung und der differentiellen Zentrifugation von hepatischen Geweben erhalten wurden, und enthalten CYP450 -Enzyme und einige biphasische Enzyme, Egy, Egts, Egts, Sts, Sts. Primäre Hepatozyten (PHCs) sind Hepatozyten, die unmittelbar nach der direkten Isolation von Tierlebern kultiviert werden, die im Grunde die Stoffwechselfunktionen der Leber aufrechterhalten, insbesondere die Enzymwerte im Einklang mit denen in vivo. In der Studie zur Stoffwechselstabilität besteht keine Notwendigkeit, die Kosten zu berücksichtigen, und zwei Testsysteme können gleichzeitig für den Test ausgewählt werden. oder das entsprechende Testsystem kann gemäß den Stoffwechseleigenschaften der Verbindung ausgewählt werden, und das Prinzip ist das, welches System eine hohe Stoffwechselrate aufweist. Im Allgemeinen sind Lebermikrosomen die beste Wahl, wenn die zusammengesetzten Moleküle mehr Wasser - löslich sind und ein Phasenstoffwechsel der Hauptstoffwechselweg ist (insbesondere über CYP); Wenn zwei - Phasenmetabolismus der Hauptweg ist, ist die Hydrolyse der Hauptstoffwechsel. Die nicht - spezifische Proteinbindung in den Lebermikrosomen ist sehr hoch, und der Metabolismus ist in den Lebermikrosomen nicht offensichtlich, der Test kann unter Verwendung primärer Hepatozyten durchgeführt werden.

F: Ist die Konzentration der Mikrosomen im Stoffwechselstabilitätstest untersucht? Wie wirkt sich von zu hoch oder zu niedrig?

A: Beim metabolischen Stabilitätstest beeinflusst die Proteinkonzentration auch die metabolische Rate, normalerweise die mikrosomale Proteinkonzentration von 0,1 mg/ml ~ 1 mg/ml, die spezifische Auswahl, wie viel Proteinkonzentration gemäß den eigenen Stoffwechseleigenschaften der Verbindung ausgewählt werden sollte. Eine zu hohe Konzentration von mikrosomalem Protein führt zu einer nicht - spezifischen Bindung des Arzneimittels an das mikrosomale Protein; Während eine zu niedrige Konzentration von mikrosomalem Protein zu einem unbedeutenden Stoffwechsel des Arzneimittels führen kann.