Ε: Πώς πρέπει να επιλέξω μικροσώματα και ηπατοκύτταρα για μελέτες μεταβολικής σταθερότητας; Μπορώ να επιλέξω μόνο ένα από αυτά για να εκπληρώσει την απαίτηση;
Α: Στη μελέτη μεταβολικής σταθερότητας, η επιλογή των μικροσωμάτων του ήπατος ή των ηπατοκυττάρων εξαρτάται κυρίως από τις μεταβολικές ιδιότητες των ενώσεων, όπου επιλέγεται η μία με υψηλό μεταβολικό ρυθμό. Γενικά, προτιμώνται τα μικροσώματα του ήπατος, ειδικά όταν τα σύνθετα μόρια είναι περισσότερο νερό - διαλυτό και ένας μεταβολισμός φάσης είναι η κύρια μεταβολική οδός (ειδικά μέσω του CYP). Τα ηπατοκύτταρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για πειράματα όταν υπάρχουν ενδείξεις δύο μεταβολισμού φάσης ως η κύρια οδός, η υδρόλυση ως η κύρια μεταβολική οδός, η υψηλή μη ειδική δέσμευση πρωτεΐνης στα μικροσώματα του ήπατος και ο μεταβολισμός στα μικροσώματα του ήπατος. Συνήθως, ένα μεταβολικό σύστημα μπορεί να επιλεγεί για να καλύψει τις ανάγκες. Εάν οι συνθήκες σε όλες τις πτυχές επιτρέπουν, είναι σίγουρα καλύτερο να επιλέξετε και τα δύο συστήματα ταυτόχρονα.
Ε: Γιατί είναι απαραίτητο να χρησιμοποιηθούν πρωτογενή ηπατοκύτταρα για δοκιμασία επαγωγής ενζύμου;
Α: Το ενζυμικό ένζυμο CYP - Η επαγόμενη δοκιμασία πρέπει να μεταβεί από "μεταγραφή", "μετάφραση" σε "μετά τη μεταφραστική τροποποίηση της πρωτεΐνης" για να ληφθεί μια ενεργή πρωτεΐνη ενζύμου CYP. Επομένως, το σύστημα δοκιμής πρέπει να είναι ηπατικά κύτταρα, όχι μικροσώματα ήπατος ή ήπαρ S9.
Ε: Γιατί πρέπει να επιλέξω τρεις πρωτοβάθμιους ηπατοκύτταρα για τον δότη για τον προσδιορισμό επαγωγής ενζύμου;
Α: Σύμφωνα με την εισαγωγή στις κατευθυντήριες γραμμές για τις αλληλεπιδράσεις φαρμάκων, πρέπει να χρησιμοποιηθούν τουλάχιστον τρεις δωρητές και το αποτέλεσμα επαγωγής κάθε δότη πρέπει να αξιολογείται ξεχωριστά. Εκτός από την παραγωγή στατιστικά σημαντικών αποτελεσμάτων, η επιλογή τριών δωρητών για το πείραμα είναι επίσης πιο σημαντική για την αξιολόγηση της Inter - μεμονωμένων διακυμάνσεων. Εάν το αποτέλεσμα από τουλάχιστον έναν δότη υπερβαίνει ένα προκαθορισμένο όριο, ο υποψήφιος για τα ναρκωτικά μπορεί να είναι επαγώγιμος και να ακολουθήσει - Απαιτείται αξιολόγηση.
Ε: Γιατί να εστιάσετε μόνο στην επαγωγή του ενζύμου του CYP και όχι στην επαγωγή ενζύμου UGT;
Α: Ο λόγος για την εστίαση στην επαγωγή της Κυπάσης είναι ότι ο μηχανισμός της επαγωγής της Κυπάσης έχει μελετηθεί με μεγαλύτερη σαφήνεια. Με άλλα λόγια, ο λόγος που δεν απαιτείται η μελέτη της επαγωγής της UGTase είναι ότι ο μηχανισμός εξακολουθεί να είναι ασαφής. Ωστόσο, αυτό δεν σημαίνει ότι η UGTase δεν θα προκληθεί. Οι κατευθυντήριες γραμμές αναφέρουν επίσης ότι δεν υπάρχει τυποποιημένο σύστημα ταξινόμησης για επαγωγείς ή αναστολείς των μεταβολών των μεταφορέων και των ενζύμων μεταβολισμού φάσης ΙΙ.
Ε: Πόσο καιρό μπορούν να επιβιώσουν τα προσκολλημένα πρωτογενή ηπατοκύτταρα μετά την ανάνηψη και πόσο καιρό μπορούν να διατηρηθούν τα ηπατοκύτταρα χωρίς προσκολλημένη καλλιέργεια μετά την ανάνηψη;
Α: Παστεριωμένα πρωτογενή ηπατοκύτταρα χρησιμοποιούνται γενικά για δοκιμασίες επαγωγής ενζύμων. Μετά την ανάκτηση των κυττάρων, τα κύτταρα αιωρούνται σε μέσο διάδοσης πλάκας, ρυθμίζονται σε κατάλληλη συγκέντρωση και καλλιεργούνται σε κολλαγόνο - Επικαλυμμένες πλάκες. Στη συνέχεια τα κύτταρα μπορούν να παστεριωθούν εντός 4 ~ 6 ώρες. Αφού τα κύτταρα είναι προσαρτημένα στον τοίχο, το μέσο συντήρησης αντικαθίσταται και διατηρείται για 18 ώρες για να εξασφαλιστεί η μέγιστη αποκατάσταση της κυτταρικής κατάστασης. Στη συνέχεια, μπορεί να διεξαχθεί δοκιμασία επαγωγής ενζύμου για την ανίχνευση της μεταβολικής δραστηριότητας και του επιπέδου επαγωγής mRNA. Από την άποψη του συνόλου του κύκλου, τα ηπατοκύτταρα μπορούν να διατηρηθούν για 6 ~ 7 ημέρες μετά την τήρηση του τοίχου. Με την πάροδο του χρόνου, η κατάσταση προσκόλλησης του κυτταρικού τοιχώματος επιδεινώνεται και τα κύτταρα θα αποσπάσουν και θα ανασταλούν.
Εάν τα προσκολλημένα ηπατοκύτταρα δεν καλλιεργηθούν, έχουμε επαληθεύσει ότι μπορούν να διατηρηθούν σε καλή κατάσταση εντός 4 ~ 6 ώρες. Δεν έχουμε ακόμη πραγματοποιήσει επαλήθευση για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα.
Ε: Τα ηπατοκύτταρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν τόσο ως εναιώρημα όσο και ως προσκολλημένα κύτταρα ανάλογα με τα διαφορετικά μέσα καλλιέργειας που χρησιμοποιούνται;
Α: Τα περισσότερα κύτταρα από στερεούς ιστούς και όργανα είναι περιφραγμένα, αλλά δεν είναι όλα τα κύτταρα που περιορίζονται όταν καλλιεργούνται σε - vitro. Το αν τα κύτταρα είναι τοίχωμα - προσκολλημένο ή όχι εξαρτάται από την κατάσταση των ίδιων των κυττάρων. Ταυτόχρονα, τα προσκολλημένα κύτταρα τοίχο χρειάζονται ειδικό μέσο καλλιέργειας και ορισμένες ειδικές ουσίες προσκόλλησης κυττάρων (π.χ. rhamnogelinogen, λαμινίνη, ινωδονεκτίνη, παράγοντας επέκτασης στον ορό) που μπορεί να συμμετέχουν στη διαδικασία προσκόλλησης κυττάρων. Συμπερασματικά, τα προσκολλημένα κύτταρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως κύτταρα εναιώρησης, αλλά τα κύτταρα εναιώρησης δεν είναι απαραίτητα διαθέσιμα για προσκολλημένη χρήση.
Ε: Ποια είναι τα πλεονεκτήματα/μειονεκτήματα της χρήσης ηπατοκυττάρων εναιωρήματος προσκολλημένου τοιχώματος; Ποια είναι τα κριτήρια απόφασης;
Α: Μετά την απομονωμένη ηπατοκύτταρα, μπορούν να καλλιεργηθούν σε εναιώρημα ή σε προσκολλημένο τοίχο. Η δραστικότητα του ενζύμου του κυτοχρώματος Ρ450 από τα καλλιεργημένα πρωτογενή ηπατοκύτταρα της ανάρτησης είναι πιο συνεπής με εκείνη του in - vivo για τα πρώτα 4 ~ 6H, και στη συνέχεια μειώνεται ταχέως με την παράταση του χρόνου. Ως εκ τούτου, τα ηπατοκύτταρα εναιώρησης χρησιμοποιούνται γενικά για τη μελέτη μεταβολικής σταθερότητας ή τη μελέτη προφίλ μεταβολίτη. Τα πρωτογενή ηπατοκύτταρα που καλλιεργούνται σε προσκολλημένο τοίχο έχουν αρκετό χρόνο για να ανακάμψουν από τη βλάβη για να διατηρήσουν τα βιολογικά χαρακτηριστικά και τη μεταβολική δράση των φυσιολογικών ηπατοκυττάρων. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιούνται γενικά για μελέτες επαγωγής ενζύμων, μελέτες κυτταροτοξικότητας φαρμάκου, μεταβολική σταθερότητα αργών μεταβολικών φαρμάκων ή μελέτες συμπερασμάτων προϊόντων.
Επί του παρόντος, δεν παρέχουμε ηλεκτρονική υπηρεσία αγοράς ιστοσελίδων. Τα προϊόντα που προστίθενται στο καλάθι αγορών μετά την εγγραφή και η σύνδεση είναι μόνο για αναφορά. Εάν πρέπει να αγοράσετε τα προϊόντα μας, αφήστε τα στοιχεία επικοινωνίας σας μέσω του κανάλι επικοινωνίας μας και θα επικοινωνήσουμε μαζί σας εγκαίρως για να ολοκληρώσετε τις υπηρεσίες μας.
Ε: Πώς επηρεάζει η μη - Ειδική δέσμευση πρωτεϊνών;
Α: Εάν ο υποψήφιος φαρμάκου δεσμεύει μη ειδικά με μικροσωματικές πρωτεΐνες, αυτό έχει ως αποτέλεσμα τροποποιημένες κινητικές παραμέτρους. Καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση πρωτεΐνης, η τιμή KM αυξάνεται, με αποτέλεσμα μια χαμηλή υποτιθέμενη εγγενή κάθαρση. Επίσης, η δέσμευση του υποψηφίου φαρμάκου σε πρωτεΐνες σε μικροσώματα μπορεί να οδηγήσει σε μεγάλες διακυμάνσεις των αποτελεσμάτων από διαφορετικά εργαστήρια και διαφορετικά συστήματα.
Q: Η συνιστώμενη συγκέντρωση μικροσωμικής πρωτεΐνης του ήπατος στο εγχειρίδιο οδηγιών του κιτ μεταβολικής σταθερότητας φάσης Ι ή φάσης II είναι 0,1 mg/ml - 1 mg/ml, αυτό σημαίνει ότι όταν χρησιμοποιείτε μικροσώματα του ήπατος, εξακολουθεί να είναι απαραίτητο να τα αραιώσετε πολύ πριν την προσθέσετε στο σύστημα;
ΕΝΑ: Δεν χρειάζεται πρώτα να αραιώνονται πρώτα τα ηπατικά μικροσώματα. Η συγκέντρωση των ηπατικών μικροσωμάτων στο κιτ είναι 20 mg/ml και η τελική συγκέντρωση των ηπατικών μικροσωμάτων στο σύστημα δοκιμής είναι 0,1 - 1 mg/ml, τα οποία μπορούν να προστεθούν αναλογικά.
Ε: Ποια είναι η συνιστώμενη πυκνότητα κυττάρων για δοκιμή μεταβολικής σταθερότητας των πρωτογενών ηπατοκυττάρων; Είναι ο υπολογισμός της εκκαθάρισης όπως και για τα μικροσώματα του ήπατος;
Α: Η συνιστώμενη πυκνότητα κυττάρων για την πρωτεύουσα δοκιμασία μεταβολικής σταθερότητας των ηπατοκυττάρων είναι 0,5 έως 2 × 106 Τα κύτταρα/mL και οι υπολογισμοί εκκαθάρισης και η επεξεργασία των αποτελεσμάτων της ηπατικής μικροσωμικής δοκιμασίας μεταβολικής σταθερότητας είναι συνεπείς.
Ε: Ποια είναι τα κύρια συστατικά στο buffer σας PBS; Περιέχει KCL και NaCl;
Α: Τα κύρια συστατικά του buffer PBS μας είναι k2HPO4 και ΧΗ2PO4, και είναι απαλλαγμένα από KCL και NaCl.
Ε: Ποιος είναι ο σκοπός των ρυθμιστικών φωσφορικών; Γιατί χρειάζεστε φωσφορικό;
Ένα: φωσφορικά ρυθμιστικά διαλύματα επιλέγονται για το σκοπό τους να μιμούνται το φυσιολογικό περιβάλλον και το φωσφορικό είναι ένα από τα σημαντικότερα ζεύγη ρυθμιστικού διαλύματος για τη διατήρηση του περιβάλλοντος του υγρού του σώματος.
Ε: Ποια είναι η συνηθισμένη ρύθμιση για την ενζυμική συγκέντρωση υποδοχέα; Υπάρχει κάποια λύση εάν η διαλυτότητα του συστήματος που πρόκειται να δοκιμαστεί είναι φτωχή;
Α: Ο προσδιορισμός επαγωγής ενζύμου πρέπει να ρυθμιστεί με 3 διαφορετικές συγκεντρώσεις, το επίπεδο συγκέντρωσης πρέπει να καλύψει την αναμενόμενη αποτελεσματική συγκέντρωση φαρμάκου αίματος στους ανθρώπους και η υψηλότερη συγκέντρωση επιλέγεται τουλάχιστον μία τάξη μεγέθους υψηλότερη από τη μέση αποτελεσματική συγκέντρωση φαρμάκου αίματος στον άνθρωπο. Εάν η διαλυτότητα στην υδατική φάση είναι φτωχή, ένας οργανικός διαλύτης μπορεί να επιλεγεί ως διαλύτης του, π.χ. DMSO, αλλά πρέπει να ελεγχθεί η ποσότητα οργανικού διαλύτη στο σύστημα.
Q: Σε μελέτες μεταβολικής σταθερότητας, είναι απαραίτητο να χρησιμοποιηθούν δύο συστήματα δοκιμών, μικροσώματα ήπατος και πρωτογενή ηπατοκύτταρα, για δοκιμές;
Ένα: Ηπατικά μικροσώματα είναι σχεδόν σφαιρική μεμβράνη κυστιδίων - όπως οι δομές που σχηματίζονται από τον εαυτό του - σύντηξη κατακερματισμένων ενζύμων ενδοπλασματικών, π.χ., UGTs, STS. Τα πρωτογενή ηπατοκύτταρα (PHCs) είναι τα ηπατοκύτταρα που καλλιεργούνται αμέσως μετά την άμεση απομόνωση από τα ζωικά συκώτια, τα οποία ουσιαστικά διατηρούν τις μεταβολικές λειτουργίες του ήπατος, ειδικά καλύτερα τη διατήρηση των επιπέδων ενζύμων σύμφωνα με εκείνες in vivo. Στη μελέτη μεταβολικής σταθερότητας, δεν υπάρχει λόγος να εξεταστεί το κόστος και δύο συστήματα δοκιμών μπορούν να επιλεγούν για τη δοκιμή ταυτόχρονα. ή το κατάλληλο σύστημα δοκιμής μπορεί να επιλεγεί σύμφωνα με τις μεταβολικές ιδιότητες της ένωσης και η αρχή είναι ότι επιλέγεται αυτό το σύστημα υψηλού μεταβολικού ρυθμού. Γενικά, τα μικροσώματα του ήπατος είναι η καλύτερη επιλογή όταν τα σύνθετα μόρια είναι περισσότερο νερό - διαλυτό και ένας μεταβολισμός φάσης είναι η κύρια μεταβολική οδός (ειδικά μέσω του CYP). Όταν ο μεταβολισμός δύο - φάσης είναι η κύρια οδός, η υδρόλυση είναι η κύρια μεταβολική οδός, η μη ειδική δέσμευση πρωτεΐνης στα μικροσώματα του ήπατος είναι πολύ υψηλή και ο μεταβολισμός δεν είναι προφανής στα μικροσώματα του ήπατος, η δοκιμή μπορεί να πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας πρωτογενή ηπατοκύτταρα.
Q: Είναι η συγκέντρωση μικροσωμάτων που εξετάστηκαν στη δοκιμή μεταβολικής σταθερότητας; Ποιο είναι το αποτέλεσμα πολύ υψηλής ή πολύ χαμηλής;
Α: Στη δοκιμή μεταβολικής σταθερότητας, η συγκέντρωση πρωτεΐνης θα επηρεάσει επίσης τον μεταβολικό ρυθμό, συνήθως επιλέγουν τη συγκέντρωση μικροσωματικών πρωτεϊνών 0,1 mg/ml ~ 1 mg/ml, η ειδική επιλογή του πόσα συγκέντρωση πρωτεΐνης θα πρέπει να επιλεγεί σύμφωνα με τις μεταβολικές ιδιότητες της ένωσης. Η υπερβολικά υψηλή συγκέντρωση μικροσωμικής πρωτεΐνης θα οδηγήσει σε μη ειδική δέσμευση του φαρμάκου στη μικροσωμική πρωτεΐνη. ενώ πολύ χαμηλή συγκέντρωση μικροσωμικής πρωτεΐνης μπορεί να οδηγήσει σε ασήμαντο μεταβολισμό του φαρμάκου.