P: ¿Cómo debo elegir microsomas y hepatocitos para estudios de estabilidad metabólica? ¿Puedo elegir solo uno de ellos para cumplir con el requisito?
R: En el estudio de estabilidad metabólica, la elección de microsomas o hepatocitos hepáticos depende principalmente de las propiedades metabólicas de los compuestos, en el que se elige el que tiene una alta tasa metabólica. En general, se prefieren los microsomas hepáticos, especialmente cuando las moléculas compuestas son más agua - soluble y un metabolismo de fase de una - es la vía metabólica principal (especialmente a través de CYP). Los hepatocitos pueden usarse para experimentos cuando hay evidencia de un metabolismo de dos fases como la vía principal, la hidrólisis como la vía metabólica principal, la alta unión de proteínas no específicas en los microsomas hepáticos y el metabolismo en los microsomas hepáticos no es evidente. Por lo general, se puede elegir un sistema metabólico para satisfacer las necesidades; Si las condiciones en todos los aspectos lo permiten, definitivamente es mejor elegir ambos sistemas al mismo tiempo.
P: ¿Por qué es necesario usar hepatocitos primarios para el ensayo de inducción enzimática?
R: Enzima CYP - El ensayo inducido debe pasar de la "transcripción", "traducción" a "Post - Modificación de la traducción de la proteína" para obtener una proteína enzimática CYP activa. Por lo tanto, el sistema de prueba debe ser células hepáticas, no microsomas hepáticos o hígado S9.
P: ¿Por qué necesito elegir tres hepatocitos primarios humanos de donantes para el ensayo de inducción enzimática?
R: Según la introducción a las pautas para las interacciones de drogas, se deben usar al menos tres donantes, y el resultado de inducción de cada donante debe evaluarse por separado. Además de producir resultados estadísticamente significativos, la elección de tres donantes para el experimento también es más importante para evaluar la variación intermedia. Si el resultado de al menos un donante excede un umbral predeterminado, el candidato al fármaco puede ser inducible y se requiere una evaluación de seguimiento.
P: ¿Por qué centrarse solo en la inducción de enzimas CYP y no en la inducción de enzimas UGT?
R: La razón para centrarse en la inducción de Cypase es que el mecanismo de inducción de Cypase se ha estudiado más claramente. En otras palabras, la razón para no requerir el estudio de la inducción de UgTasa es que el mecanismo aún no está claro; Sin embargo, esto no significa que UGTase no sea inducido. Las pautas también indican que no existe un sistema de clasificación estandarizado para inductores o inhibidores de transportadores y enzimas de metabolismo de fase II.
P: ¿Cuánto tiempo pueden sobrevivir los hepatocitos primarios adherentes después de la reanimación, y cuánto tiempo se pueden mantener los hepatocitos sin cultivo adherente después de la reanimación?
R: Los hepatocitos primarios pasteurizados generalmente se usan para ensayos de inducción enzimática. Después de la recuperación de las células, las células se suspenden en medio de propagación de la placa, se ajustan a la concentración apropiada y se cultivan en placas recubiertas de colágeno; entonces las células se pueden pasteurizar en 4 ~ 6 horas. Después de unir las celdas a la pared, el medio de mantenimiento se reemplaza y se mantiene durante 18 h para garantizar la máxima restauración del estado de la celda. A continuación, se puede realizar un ensayo de inducción enzimática para detectar la actividad metabólica y el nivel de inducción de ARNm. Desde la perspectiva de todo el ciclo, los hepatocitos se pueden mantener durante 6 ~ 7 días después de la adherencia a la pared. A medida que pasa el tiempo, el estado de adherencia a la pared celular se deteriora y las células se separarán y suspenderán.
Si los hepatocitos adherentes no se cultivan, hemos verificado que pueden mantenerse en un buen estado dentro de las 4 ~ 6 horas. Todavía no hemos llevado a cabo la verificación durante un período más largo.
P: ¿Se pueden usar hepatocitos como suspensión y células adherentes dependiendo de los diferentes medios de cultivo utilizados?
R: La mayoría de las células de tejidos y órganos sólidos están amuralladas, pero no todas las células se amurallan cuando se cultivan en - vitro. Si las células son de pared - adherentes o no depende del estado de las células mismas; Al mismo tiempo, la pared - Las células adherentes necesitan un medio de cultivo específico y algunas sustancias especiales de adhesión celular (por ejemplo, ramnogelinógeno, laminina, fibronectina, factor de expansión sérica) que pueden participar en el proceso de unión celular. En conclusión, las células adherentes pueden usarse como células suspensivas, pero las células de suspensión no están necesariamente disponibles para el uso adherente.
P: ¿Cuáles son las ventajas/desventajas del uso de hepatocitos de suspensión de versos de pared adherentes? ¿Cuáles son los criterios de decisión?
R: Después de aislarse los hepatocitos, se pueden cultivar en suspensión o en la pared adherente. La actividad de la enzima citocromo P450 de los hepatocitos primarios cultivados en suspensión es más consistente con la de en - vivo durante los primeros 4 ~ 6h, luego disminuye rápidamente con la prolongación del tiempo. Por lo tanto, los hepatocitos de suspensión generalmente se usan para el estudio de estabilidad metabólica o el estudio de perfiles de metabolitos. Los hepatocitos primarios cultivados en la pared adherente tienen suficiente tiempo para recuperarse del daño para mantener las características biológicas y la actividad metabólica de los hepatocitos normales. Por lo tanto, generalmente se usan para estudios de inducción enzimática, estudios de citotoxicidad de fármacos, estabilidad metabólica de fármacos metabolizantes lentos o estudios de inferencia de productos.
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P: ¿Cómo afecta la unión de proteínas no específica los resultados de las pruebas?
A: Si el candidato al fármaco se une específicamente a las proteínas microsomales, esto da como resultado parámetros cinéticos alterados. A medida que aumenta la concentración de proteína, el valor de KM aumenta, lo que resulta en una baja clara de presunción intrínseca. Además, la unión del candidato al fármaco a las proteínas en los microsomas puede dar lugar a grandes variaciones en los resultados de diferentes laboratorios y diferentes sistemas.
P: La concentración recomendada de proteína microsómica hepática en el manual de instrucciones del kit de estabilidad metabólica de fase I o fase II es de 0.1 mg/ml - 1 mg/ml, ¿significa que al usar microsomas hepáticos, todavía es necesario diluirlos bien antes de agregarlos al sistema?
A: No hay necesidad de diluir primero los microsomas hepáticos; La concentración de microsomas hepáticos en el kit es de 20 mg/ml y la concentración final de microsomas hepáticos en el sistema de prueba es 0.1 - 1 mg/ml, lo que se puede agregar proporcionalmente.
P: ¿Cuál es la densidad celular recomendada para las pruebas de estabilidad metabólica de los hepatocitos primarios? ¿Es el cálculo de la eliminación el mismo que para los microsomas hepáticos?
A: La densidad celular recomendada para el ensayo de estabilidad metabólica de hepatocitos primarios es de 0.5 a 2 × 106 Células/ml, y los cálculos de eliminación y el procesamiento de los resultados del ensayo de estabilidad metabólica microsomal hepática son consistentes.
P: ¿Cuáles son los ingredientes principales de su búfer PBS? ¿Contiene KCL y NaCl?
A ： Los componentes principales de nuestro búfer PBS son K2HPO4 y kh2PO4, y están libres de KCL y NaCl.
P: ¿Cuál es el propósito de los tampones de fosfato? ¿Por qué necesitas fosfato?
A: se eligen tampones de fosfato con su propósito de imitar el entorno fisiológico, y el fosfato es uno de los pares de tampón más importantes para mantener el entorno fluido del cuerpo.
P: ¿Cuál es la configuración habitual para la concentración de receptores inducidos en enzimas? ¿Hay alguna solución si la solubilidad del sistema a probar es pobre?
A: El ensayo de inducción enzimática debe establecerse con 3 concentraciones diferentes, el nivel de concentración debe cubrir la concentración esperada de fármacos sanguíneos efectivos en humanos, y la concentración más alta se elige para ser al menos un orden de magnitud más alto que la concentración promedio de fármacos sanguíneos efectivos en humanos. Si la solubilidad en la fase acuosa es pobre, se puede elegir un solvente orgánico como solvente, p. DMSO, pero la cantidad de solvente orgánico agregado al sistema debe controlarse.
P: En los estudios de estabilidad metabólica, ¿es necesario usar dos sistemas de prueba, microsomas hepáticos y hepatocitos primarios, para las pruebas?
A: los microsomas hepáticos son vesículas de membrana casi esféricas - Estructuras similares a la autopista de retículo endoplásmico fragmentado obtenidos durante la homogeneización y la centrifugación diferencial de los tejidos hepáticos, y contienen enzimas CYP450 y algunas enzimas bifásicas, e.g.gts, STS. Los hepatocitos primarios (PHC) son hepatocitos cultivados inmediatamente después del aislamiento directo de los hígados de los animales, que básicamente mantienen las funciones metabólicas del hígado, especialmente preservando mejor los niveles de enzimas consistentes con los in vivo. En el estudio de estabilidad metabólica, no es necesario considerar el costo, y se pueden seleccionar dos sistemas de prueba para la prueba al mismo tiempo; o el sistema de prueba apropiado se puede seleccionar de acuerdo con las propiedades metabólicas del compuesto, y el principio es cuyo sistema tiene una alta tasa metabólica. En general, los microsomas hepáticos son la mejor opción cuando las moléculas compuestas son más agua - soluble y un metabolismo de fase de una - es la principal vía metabólica (especialmente a través de CYP); Cuando el metabolismo de dos fases es la vía principal, la hidrólisis es la vía metabólica principal, la unión de proteínas no - específica en los microsomas hepáticos es muy alta, y el metabolismo no es obvio en los microsomas hepáticos, la prueba se puede llevar a cabo utilizando hepatocitos primarios.
P: ¿Se examina la concentración de microsomas en la prueba de estabilidad metabólica? ¿Cuál es el efecto de demasiado alto o demasiado bajo?
A: En la prueba de estabilidad metabólica, la concentración de proteína también afectará la tasa metabólica, generalmente elegir la concentración de proteína microsómica de 0.1 mg/ml ~ 1 mg/ml, la elección específica de cuánta concentración de proteína debe seleccionarse de acuerdo con las propias propiedades metabólicas del compuesto. Una concentración demasiado alta de proteína microsómica conducirá a una unión no específica del fármaco a la proteína microsomal; mientras que una concentración demasiado baja de proteína microsómica puede conducir a un metabolismo insignificante del fármaco.