Q: Comment dois-je choisir des microsomes et des hépatocytes pour les études de stabilité métabolique? Puis-je choisir un seul d'entre eux pour répondre à l'exigence?
R: Dans l'étude de stabilité métabolique, le choix des microsomes hépatiques ou des hépatocytes dépend principalement des propriétés métaboliques des composés, dans lesquelles celui avec un taux métabolique élevé est choisi. En général, les microsomes hépatiques sont préférés, surtout lorsque les molécules composées sont plus d'eau - soluble et un - métabolisme de phase est la principale voie métabolique (en particulier via le CYP). Les hépatocytes peuvent être utilisés pour des expériences lorsqu'il existe des preuves de deux - métabolisme de phase comme voie principale, l'hydrolyse comme la principale voie métabolique, la liaison des protéines non spécifiques élevées dans les microsomes hépatiques et le métabolisme dans les microsomes hépatiques n'est pas évident. Habituellement, un système métabolique peut être choisi pour répondre aux besoins; Si les conditions dans tous les aspects le permettent, il est certainement préférable de choisir les deux systèmes en même temps.
Q: Pourquoi est-il nécessaire d'utiliser le test d'hépatocytes primaires pour l'induction enzymatique?
A: le test induit enzymatique du CYP doit passer de la "transcription", "traduction" en "post - modification translationnelle de la protéine" pour obtenir une protéine enzymatique CYP active. Par conséquent, le système de test doit être des cellules hépatiques, pas des microsomes hépatiques ou du foie S9.
Q: Pourquoi dois-je choisir trois hépatocytes primaires humains donneurs pour le test d'induction enzymatique?
R: Selon l'introduction des directives pour les interactions médicamenteuses, au moins trois donneurs doivent être utilisés et le résultat d'induction de chaque donneur doit être évalué séparément. En plus de produire des résultats statistiquement significatifs, le choix de trois donneurs pour l'expérience est également plus important pour évaluer l'inter - variation individuelle. Si le résultat d'au moins un donneur dépasse un seuil prédéterminé, le candidat du médicament peut être inductible et une évaluation à la hausse est requise.
Q: Pourquoi se concentrer uniquement sur l'induction des enzymes CYP et non sur l'induction de l'enzyme UGT?
R: La raison de se concentrer sur l'induction des cypases est que le mécanisme de l'induction de la cypase a été étudié plus clairement. En d'autres termes, la raison de ne pas nécessiter l'étude de l'induction de l'Ugtase est que le mécanisme n'est pas encore clair; Cependant, cela ne signifie pas que la UGTase ne sera pas induite. Les directives indiquent également qu'il n'y a pas de système de classification standardisé pour les inducteurs ou les inhibiteurs des transporteurs et des enzymes de métabolisme de phase II.
Q: Combien de temps les hépatocytes primaires adhérents peuvent-ils survivre après réanimation et combien de temps les hépatocytes peuvent-ils être maintenus sans culture adhérente après réanimation?
R: Les hépatocytes primaires pasteurisés sont généralement utilisés pour les tests d'induction enzymatique. Après la récupération des cellules, les cellules sont en suspension dans le milieu étalant de la plaque, ajustées à une concentration appropriée et cultivées dans des plaques enrobées de collagène; Ensuite, les cellules peuvent être pasteurisées en 4 à 6 heures. Une fois les cellules attachées à la paroi, le milieu de maintenance est remplacé et maintenu pendant 18 h pour assurer une restauration maximale de l'état cellulaire. Ensuite, un test d'induction enzymatique peut être effectué pour détecter l'activité métabolique et le niveau d'induction de l'ARNm. Du point de vue de l'ensemble du cycle, les hépatocytes peuvent être maintenus pendant 6 ~ 7 jours après l'adhésion murale. Au fil du temps, l'état d'adhésion de la paroi cellulaire se détériore et les cellules se détachent et se suspendent.
Si les hépatocytes adhérents ne sont pas cultivés, nous avons vérifié qu'ils peuvent être maintenus en bon état dans les 4 ~ 6 heures. Nous n'avons pas encore effectué de vérification pendant une période plus longue.
Q: Les hépatocytes peuvent être utilisés à la fois comme suspension et cellules adhérentes en fonction des différents milieux de culture utilisés?
R: La plupart des cellules des tissus et organes solides sont clôturées, mais toutes les cellules ne sont pas parlées lorsqu'elles sont cultivées en - vitro. Que les cellules soient la paroi - adhérente ou non dépend de l'état des cellules elles-mêmes; Dans le même temps, les cellules de la paroi - adhérentes ont besoin d'un milieu de culture spécifique et certaines substances d'adhésion pro-cellulaire spéciales (par exemple, rhamnogelinogène, laminine, fibronectine, facteur d'expansion du sérum) qui peuvent participer au processus de fixation cellulaire. En conclusion, les cellules adhérentes peuvent être utilisées comme cellules de suspension, mais les cellules de suspension ne sont pas nécessairement disponibles pour une utilisation adhérente.
Q: Quels sont les avantages / inconvénients de l'utilisation de versets de paroi adhérents hépatocytes? Quels sont les critères de décision?
R: Une fois les hépatocytes isolés, ils peuvent être cultivés en suspension ou en paroi adhérente. L'activité de l'enzyme du cytochrome P450 à partir des hépatocytes primaires cultivées en suspension est la plus cohérente avec celle de In - vivo pendant les 4 premiers 6h, puis diminue rapidement avec la prolongation du temps. Par conséquent, les hépatocytes de suspension sont généralement utilisés pour l'étude de stabilité métabolique ou l'étude de profilage métabolite. Les hépatocytes primaires cultivés dans la paroi adhérente ont suffisamment de temps pour se remettre des dommages pour maintenir les caractéristiques biologiques et l'activité métabolique des hépatocytes normaux. Par conséquent, ils sont généralement utilisés pour les études d'induction enzymatiques, les études de cytotoxicité des médicaments, la stabilité métabolique des médicaments de métabolisation lents ou des études d'inférence des produits.
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Q ： Comment la liaison aux protéines non spécifique affecte-t-elle les résultats des tests?
A: Si le médicament candidat se lie non - spécifiquement aux protéines microsomales, cela se traduit par des paramètres cinétiques modifiés. À mesure que la concentration en protéines augmente, la valeur KM augmente, résultant en une faible clairance intrinsèque présumée. De plus, la liaison du médicament candidat aux protéines dans les microsomes peut entraîner de grandes variations des résultats de différents laboratoires et différents systèmes.
Q ： La concentration recommandée de protéine microsomale hépatique dans le manuel d'instructions du kit de stabilité métabolique de phase I ou de phase II est de 0,1 mg / ml - 1 mg / ml, cela signifie-t-il que lorsque vous utilisez des microsomes hépatiques, il est toujours nécessaire de les diluer bien avant de les ajouter au système?
UN: Il n'est pas nécessaire de diluer d'abord les microsomes hépatiques; La concentration de microsomes hépatiques dans le kit est de 20 mg / ml et la concentration finale de microsomes hépatiques dans le système de test est de 0,1 - 1 mg / ml, ce qui peut être ajouté proportionnellement.
Q ： Quelle est la densité cellulaire recommandée pour les tests de stabilité métabolique des hépatocytes primaires? Le calcul du dégagement est-il le même que pour les microsomes hépatiques?
A: la densité cellulaire recommandée pour le test de stabilité métabolique des hépatocytes primaires est de 0,5 à 2 × 106 Les cellules / ml, et les calculs de clairance et le traitement des résultats du test de stabilité métabolique microsomale hépatique sont cohérents.
Q ： Quels sont les principaux ingrédients de votre tampon PBS? Contient-il KCL et NACL?
A ： Les principaux composants de notre tampon PBS sont k2HPO4 et kh2PO4, et sont exempts de KCL et NaCl.
Q ： Quel est le but des tampons de phosphate? Pourquoi avez-vous besoin de phosphate?
A ： tampons de phosphate sont choisis dans leur but d'imiter l'environnement physiologique, et le phosphate est l'une des paires de tampons les plus importantes pour maintenir l'environnement fluide du corps.
Q ： Quel est le réglage habituel de la concentration en enzyme de récepteur induite? Existe-t-il une solution si la solubilité du système à tester est mauvaise?
A: le test d'induction enzymatique doit être mis en place avec 3 concentrations différentes, le niveau de concentration doit couvrir la concentration de médicament sanguin efficace attendue chez l'homme, et la concentration la plus élevée est choisie pour être au moins un ordre de grandeur supérieur à la concentration de médicament sanguin efficace moyenne chez l'homme. Si la solubilité dans la phase aqueuse est mauvaise, un solvant organique peut être choisi comme solvant, par ex. DMSO, mais la quantité de solvant organique ajouté au système doit être contrôlée.
Q ： Dans les études de stabilité métabolique, est-il nécessaire d'utiliser deux systèmes de test, des microsomes hépatiques et des hépatocytes primaires, pour les tests?
A: les microsomes hépatiques sont presque des structures de vésicules membranaires sphériques - Les structures formées par l'auto-fusion du réticulum endoplasmique fragmenté obtenu lors de l'homogénéisation et de la centrifugation différentielle des tissus hépatiques, et contiennent des enzymes CYP450 et certains enzymes biphasiques, par exemple, UGTS, STS. Les hépatocytes primaires (PHC) sont des hépatocytes cultivés immédiatement après l'isolement direct des foies animaux, qui maintiennent essentiellement les fonctions métaboliques du foie, en particulier mieux en préservant les niveaux d'enzymes compatibles avec ceux in vivo. Dans l'étude de stabilité métabolique, il n'est pas nécessaire de considérer le coût, et deux systèmes de test peuvent être sélectionnés pour le test en même temps; ou le système de test approprié peut être sélectionné en fonction des propriétés métaboliques du composé, et le principe est celui du système élevé que le taux métabolique est sélectionné. En général, les microsomes hépatiques sont le meilleur choix lorsque les molécules composées sont plus d'eau - soluble et un - métabolisme de phase est la principale voie métabolique (en particulier via le CYP); Lorsque deux - le métabolisme de phase est la voie principale, l'hydrolyse est la voie métabolique principale, la liaison des protéines non spécifique dans les microsomes hépatiques est très élevée et le métabolisme n'est pas évident dans les microsomes hépatiques, le test peut être effectué en utilisant des hépatocytes primaires.
Q ： La concentration de microsomes est-elle examinée dans le test de stabilité métabolique? Quel est l'effet de trop haut ou trop bas?
A: Dans le test de stabilité métabolique, la concentration en protéines affectera également le taux métabolique, choisissez généralement la concentration microsomale de protéines de 0,1 mg / ml ~ 1 mg / ml, le choix spécifique de la quantité de concentration en protéines doit être sélectionnée en fonction des propriétés métaboliques du composé. Une concentration trop élevée de protéine microsomale entraînera une liaison non spécifique du médicament à la protéine microsomale; Bien que trop faible, une concentration de protéines microsomales peut entraîner un métabolisme insignifiant du médicament.