प्रश्न: मुझे चयापचय स्थिरता अध्ययन के लिए माइक्रोसोम और हेपेटोसाइट्स कैसे चुनना चाहिए? क्या मैं आवश्यकता को पूरा करने के लिए उनमें से केवल एक को चुन सकता हूं?
ए: चयापचय स्थिरता अध्ययन में, यकृत माइक्रोसोम या हेपेटोसाइट्स की पसंद मुख्य रूप से यौगिकों के चयापचय गुणों पर निर्भर करती है, जिसमें एक उच्च चयापचय दर वाला चुना जाता है। सामान्य तौर पर, यकृत माइक्रोसोम को प्राथमिकता दी जाती है, खासकर जब यौगिक अणु अधिक पानी होते हैं। घुलनशील और एक चरण चयापचय मुख्य चयापचय मार्ग (विशेष रूप से CYP के माध्यम से) है। हेपेटोसाइट्स का उपयोग प्रयोगों के लिए किया जा सकता है जब दो के सबूत होते हैं। प्रमुख मार्ग के रूप में चरण चयापचय, प्रमुख चयापचय मार्ग के रूप में हाइड्रोलिसिस, यकृत माइक्रोसोम में उच्च निरर्थक प्रोटीन बाइंडिंग, और यकृत माइक्रोसोम में चयापचय स्पष्ट नहीं है। आमतौर पर, एक चयापचय प्रणाली को जरूरतों को पूरा करने के लिए चुना जा सकता है; यदि सभी पहलुओं में स्थितियां अनुमति देती हैं, तो एक ही समय में दोनों सिस्टम का चयन करना निश्चित रूप से सबसे अच्छा है।
प्रश्न: एंजाइम इंडक्शन परख के लिए प्राथमिक हेपेटोसाइट्स का उपयोग करना क्यों आवश्यक है?
A: CYP एंजाइम - प्रेरित परख को एक सक्रिय CYP एंजाइम प्रोटीन प्राप्त करने के लिए "ट्रांसक्रिप्शन", "ट्रांसलेशन" से "पोस्ट - ट्रांसलेशनल संशोधन" से जाने की जरूरत है। इसलिए, परीक्षण प्रणाली यकृत कोशिकाएं होनी चाहिए, न कि यकृत माइक्रोसोम या यकृत एस 9।
प्रश्न: मुझे एंजाइम इंडक्शन परख के लिए तीन दाता मानव प्राथमिक हेपेटोसाइट्स चुनने की आवश्यकता क्यों है?
A: ड्रग इंटरैक्शन के लिए दिशानिर्देशों के परिचय के अनुसार, कम से कम तीन दाताओं का उपयोग किया जाना चाहिए, और प्रत्येक दाता के प्रेरण परिणाम का अलग -अलग मूल्यांकन किया जाना चाहिए। सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण परिणामों का उत्पादन करने के अलावा, प्रयोग के लिए तीन दाताओं का विकल्प भी अंतर का आकलन करने के लिए अधिक महत्वपूर्ण है। व्यक्तिगत भिन्नता। यदि कम से कम एक दाता से परिणाम एक पूर्व निर्धारित सीमा से अधिक है, तो ड्रग उम्मीदवार को प्रेरित किया जा सकता है और पालन किया जा सकता है। अप मूल्यांकन की आवश्यकता है।
प्रश्न: क्यों केवल CYP एंजाइम इंडक्शन पर ध्यान केंद्रित करें और UGT एंजाइम इंडक्शन पर नहीं?
A: Cypase इंडक्शन पर ध्यान केंद्रित करने का कारण यह है कि Cypase इंडक्शन के तंत्र का अधिक स्पष्ट रूप से अध्ययन किया गया है। दूसरे शब्दों में, Ugtase प्रेरण के अध्ययन की आवश्यकता नहीं होने का कारण यह है कि तंत्र अभी भी स्पष्ट नहीं है; हालांकि, इसका मतलब यह नहीं है कि UGTase प्रेरित नहीं होगा। दिशानिर्देश यह भी बताते हैं कि ट्रांसपोर्टरों और चरण II चयापचय एंजाइमों के Inducers या अवरोधकों के लिए कोई मानकीकृत वर्गीकरण प्रणाली नहीं है।
प्रश्न: पुनर्जीवन के बाद प्राथमिक हेपेटोसाइट्स कब तक जीवित रह सकते हैं, और पुनर्जीवन के बाद पालन की संस्कृति के बिना हेपेटोसाइट्स को कब तक बनाए रखा जा सकता है?
एक: पाश्चुरीकृत प्राथमिक हेपेटोसाइट्स का उपयोग आम तौर पर एंजाइम इंडक्शन assays के लिए किया जाता है। सेल रिकवरी के बाद, कोशिकाओं को प्लेट फैलने वाले माध्यम में निलंबित कर दिया जाता है, उचित एकाग्रता के लिए समायोजित किया जाता है, और कोलेजन में सुसंस्कृत होता है। लेपित प्लेटें; तब कोशिकाओं को 4 ~ 6 घंटे के भीतर पाश्चराइज किया जा सकता है। कोशिकाओं को दीवार से जुड़े होने के बाद, सेल स्टेट की अधिकतम बहाली सुनिश्चित करने के लिए रखरखाव माध्यम को बदल दिया जाता है और 18 घंटे के लिए बनाए रखा जाता है। अगला, एंजाइम इंडक्शन परख चयापचय गतिविधि और mRNA इंडक्शन स्तर का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। पूरे चक्र के दृष्टिकोण से, हेपेटोसाइट्स को दीवार के पालन के बाद 6 ~ 7 दिनों के लिए बनाए रखा जा सकता है। जैसे -जैसे समय बीतता है, सेल की दीवार का पालन करने की स्थिति खराब हो जाती है, और कोशिकाएं अलग हो जाएंगी और निलंबित हो जाएंगी।
यदि आसन्न हेपेटोसाइट्स को सुसंस्कृत नहीं किया जाता है, तो हमने सत्यापित किया है कि उन्हें 4 ~ 6 घंटे के भीतर एक अच्छी स्थिति में बनाए रखा जा सकता है। हमने अभी तक लंबी अवधि के लिए सत्यापन नहीं किया है।
प्रश्न: हेपेटोसाइट्स का उपयोग निलंबन और पालन कोशिकाओं दोनों के रूप में किया जा सकता है जो विभिन्न संस्कृति मीडिया के आधार पर उपयोग किया जाता है?
एक: ठोस ऊतकों और अंगों से अधिकांश कोशिकाओं को दीवार पर रखा जाता है, लेकिन सभी कोशिकाओं को दीवार पर नहीं रखा जाता है जब इन विट्रो में सुसंस्कृत होता है। कोशिकाएं दीवार हैं। एक ही समय में, दीवार - आसन्न कोशिकाओं को विशिष्ट संस्कृति माध्यम और कुछ विशेष समर्थक की आवश्यकता होती है। सेल आसंजन पदार्थ (जैसे, रामनोगेलिनोजेन, लैमिनिन, फाइब्रोनेक्टिन, सीरम विस्तार कारक) जो सेल अटैचमेंट की प्रक्रिया में भाग ले सकते हैं। निष्कर्ष में, आसन्न कोशिकाओं को निलंबन कोशिकाओं के रूप में उपयोग किया जा सकता है, लेकिन निलंबन कोशिकाएं जरूरी नहीं कि आसन्न उपयोग के लिए उपलब्ध हों।
प्रश्न: पालन की दीवार छंद निलंबन हेपेटोसाइट्स का उपयोग करने के क्या फायदे/नुकसान हैं? निर्णय मानदंड क्या हैं?
A: हेपेटोसाइट्स को अलग -थलग होने के बाद, उन्हें निलंबन में या पालन की दीवार में सुसंस्कृत किया जा सकता है। निलंबन से सुसंस्कृत प्राथमिक हेपेटोसाइट्स से साइटोक्रोम P450 एंजाइम की गतिविधि पहले 4 ~ 6h के लिए इन के साथ सबसे अधिक सुसंगत है, फिर समय के लंबे समय तक तेजी से घट जाती है। इसलिए, सस्पेंशन हेपेटोसाइट्स का उपयोग आम तौर पर चयापचय स्थिरता अध्ययन या मेटाबोलाइट प्रोफाइलिंग अध्ययन के लिए किया जाता है। अनुवर्ती दीवार में सुसंस्कृत प्राथमिक हेपेटोसाइट्स के पास सामान्य हेपेटोसाइट्स की जैविक विशेषताओं और चयापचय गतिविधि को बनाए रखने के लिए क्षति से उबरने के लिए पर्याप्त समय होता है। इसलिए, वे आम तौर पर एंजाइम इंडक्शन अध्ययन, दवा साइटोटॉक्सिसिटी अध्ययन, धीमी गति से चयापचय दवाओं की चयापचय स्थिरता या उत्पाद निष्कर्ष अध्ययन के लिए उपयोग किए जाते हैं।
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Q ： गैर - विशिष्ट प्रोटीन बाइंडिंग परीक्षण परिणामों को कैसे प्रभावित करता है?
A ： यदि ड्रग उम्मीदवार गैर -बांधता है। जैसे -जैसे प्रोटीन एकाग्रता बढ़ती है, केएम मूल्य बढ़ता है, जिसके परिणामस्वरूप कम प्रकल्पित आंतरिक निकासी होती है। इसके अलावा, माइक्रोसोम में प्रोटीन के लिए ड्रग उम्मीदवार के बंधन के परिणामस्वरूप विभिन्न प्रयोगशालाओं और विभिन्न प्रणालियों के परिणामों में बड़े बदलाव हो सकते हैं।
Q ： चरण I या चरण II मेटाबॉलिक स्टेबिलिटी किट के निर्देश मैनुअल में यकृत माइक्रोसोमल प्रोटीन की अनुशंसित एकाग्रता 0.1 मिलीग्राम/एमएल 1 मिलीग्राम/एमएल है, क्या इसका मतलब यह है कि यकृत माइक्रोसोम का उपयोग करते समय, उन्हें सिस्टम में जोड़ने से पहले उन्हें अच्छी तरह से पतला करना आवश्यक है?
ए: पहले यकृत माइक्रोसोम को पतला करने की आवश्यकता नहीं है; किट में यकृत माइक्रोसोम की एकाग्रता 20 मिलीग्राम/एमएल है और परीक्षण प्रणाली में यकृत माइक्रोसोम की अंतिम एकाग्रता 0.1 - 1 मिलीग्राम/एमएल है, जिसे आनुपातिक रूप से जोड़ा जा सकता है।
Q ： प्राथमिक हेपेटोसाइट्स के चयापचय स्थिरता परीक्षण के लिए अनुशंसित सेल घनत्व क्या है? क्या क्लीयरेंस गणना लीवर माइक्रोसोम के लिए समान है?
A ： प्राथमिक हेपेटोसाइट चयापचय स्थिरता परख के लिए अनुशंसित सेल घनत्व 0.5 से 2 × 10 है6 कोशिकाओं/एमएल, और निकासी गणना और यकृत माइक्रोसोमल चयापचय स्थिरता परख के परिणामों के प्रसंस्करण सुसंगत हैं।
Q ： आपके PBS बफर में मुख्य सामग्री क्या हैं? क्या इसमें kcl और NaCl शामिल है?
हमारे पीबीएस बफर के मुख्य घटक k हैं2एचपीओ4 और केएच2PO4, और Kcl और NaCl से मुक्त हैं।
क्यू ： फॉस्फेट बफ़र्स का उद्देश्य क्या है? आपको फॉस्फेट की आवश्यकता क्यों है?
शारीरिक वातावरण की नकल करने के उनके उद्देश्य के लिए एक ： फॉस्फेट बफ़र्स को चुना जाता है, और फॉस्फेट शरीर के द्रव वातावरण को बनाए रखने के लिए सबसे महत्वपूर्ण बफर जोड़े में से एक है।
Q ： एंजाइम के लिए सामान्य सेटिंग क्या है - प्रेरित रिसेप्टर एकाग्रता? क्या कोई समाधान है यदि परीक्षण किया जाना सिस्टम की घुलनशीलता खराब है?
A एंजाइम इंडक्शन परख को 3 अलग -अलग सांद्रता के साथ स्थापित करने की आवश्यकता है, एकाग्रता स्तर को मनुष्यों में अपेक्षित प्रभावी रक्त दवा सांद्रता को कवर करने की आवश्यकता है, और उच्चतम एकाग्रता को कम से कम एक क्रम का परिमाण का एक क्रम है जो मनुष्यों में औसत प्रभावी रक्त दवा सांद्रता से अधिक है। यदि जलीय चरण में घुलनशीलता खराब है, तो एक कार्बनिक विलायक को इसके विलायक के रूप में चुना जा सकता है, उदा। DMSO, लेकिन सिस्टम में जोड़े गए कार्बनिक विलायक की मात्रा को नियंत्रित करने की आवश्यकता है।
क्यू ： चयापचय स्थिरता अध्ययन में, क्या परीक्षण के लिए दो परीक्षण प्रणालियों, यकृत माइक्रोसोम और प्राथमिक हेपेटोसाइट्स का उपयोग करना आवश्यक है?
एक ： हेपेटिक माइक्रोसोम लगभग गोलाकार झिल्ली पुटिका हैं। स्वयं द्वारा गठित संरचनाओं की तरह। हेपेटिक ऊतकों के समरूपता और अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान प्राप्त खंडित एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम का संलयन, और इसमें CYP450 एंजाइम और कुछ द्विध्रुवीय एंजाइम, यूजीटीएस, यूजीटीएस शामिल हैं। प्राथमिक हेपेटोसाइट्स (PHCs) जानवरों के गोताखोरों से प्रत्यक्ष अलगाव के तुरंत बाद सुसंस्कृत हेपेटोसाइट्स हैं, जो मूल रूप से जिगर के चयापचय कार्यों को बनाए रखते हैं, विशेष रूप से विवो में उन लोगों के अनुरूप एंजाइम के स्तर को बेहतर ढंग से संरक्षित करते हैं। चयापचय स्थिरता अध्ययन में, लागत पर विचार करने की कोई आवश्यकता नहीं है, और एक ही समय में परीक्षण के लिए दो परीक्षण प्रणालियों को चुना जा सकता है; या उपयुक्त परीक्षण प्रणाली को यौगिक के चयापचय गुणों के अनुसार चुना जा सकता है, और सिद्धांत यह है कि किस प्रणाली में एक उच्च चयापचय दर का चयन किया जाता है। सामान्य तौर पर, लीवर माइक्रोसोम सबसे अच्छा विकल्प होता है जब यौगिक अणु अधिक पानी होते हैं। घुलनशील और एक। चरण चयापचय मुख्य चयापचय मार्ग है (विशेष रूप से CYP के माध्यम से); जब दो - चरण चयापचय मुख्य मार्ग होता है, तो हाइड्रोलिसिस मुख्य चयापचय मार्ग होता है, नॉन। लीवर माइक्रोसोम में विशिष्ट प्रोटीन बाइंडिंग बहुत अधिक होता है, और यकृत माइक्रोसोम में चयापचय स्पष्ट नहीं होता है, परीक्षण प्राथमिक हेपेटोसाइट्स का उपयोग करके किया जा सकता है।
क्यू ： क्या चयापचय स्थिरता परीक्षण में जांच की गई माइक्रोसोम की एकाग्रता है? बहुत अधिक या बहुत कम का प्रभाव क्या है?
A ： चयापचय स्थिरता परीक्षण में, प्रोटीन एकाग्रता भी चयापचय दर को प्रभावित करेगी, आमतौर पर 0.1 मिलीग्राम/एमएल ~ 1 मिलीग्राम/एमएल के माइक्रोसोमल प्रोटीन एकाग्रता का चयन करती है, यौगिक के स्वयं के चयापचय गुणों के अनुसार प्रोटीन एकाग्रता को कितना प्रोटीन एकाग्रता का चयन किया जाना चाहिए। माइक्रोसोमल प्रोटीन की बहुत अधिक एकाग्रता से माइक्रोसोमल प्रोटीन के लिए दवा का विशिष्ट बंधन नहीं होगा; जबकि बहुत कम माइक्रोसोमल प्रोटीन की एकाग्रता से दवा का महत्वहीन चयापचय हो सकता है।