Ki jan yo prepare glisad pou assay komèt
Akomèt assay, ke yo rele tou yon sèl - selil jèl elèktroforèz, se yon teknik sansib ak versatile pou quantification domaj ADN nan selil endividyèl yo. Preparasyon segondè - KaliteKomèt assay gliseS se yon etap kritik ki detèmine fyab la ak repwodibilite nan rezilta yo épreuve. Atik sa a gen pou objaktif pou bay yon gid konplè sou prepare glisad pou komèt tès, entegre Sur soti nan ekspè nan jaden an. Nou pral kouvri chak etap enpòtan, ki soti nan seleksyon selil nan entèpretasyon done, asire ou reyalize pi bon rezilta yo posib.Entwodiksyon nan komèt tès ak enpòtans li yo
● Apèsi sou lekòl la nan assay komèt
Tès nan komèt, devlope nan fen ane 1980 yo, se yon zouti pwisan pou detekte repo ADN Strand nan selil ekaryotik endividyèl. Li se lajman ki itilize nan jaden tankou tès jenotoksisite, epidemyoloji molekilè, ak anviwònman biomonitoring. Prensip la nan tès la komèt enplike nan selilè selil nan agaroz, lis yo retire manbràn ak pwoteyin, ak Lè sa a, soumèt ADN nan elèktroforèz. Imaj la ki kapab lakòz, fè l sanble souvan yon komèt, pèmèt pou quantification nan domaj ADN.● Aplikasyon nan deteksyon domaj ADN
Assay komèt yo patikilyèman valab nan detekte domaj ADN ki te koze pa toksin anviwònman an, radyasyon, ak edikaman. Yo menm tou yo jwe yon wòl esansyèl nan evalye efikasite nan mekanis reparasyon ADN nan kalite selil divès kalite. Chèchè yo itilize assay komèt pou etidye kansè, aje, ak lòt maladi ki lye ak domaj ADN.● Enpòtans nan tès jenotoksisite
Siyifikasyon regilasyon ak rechèch nan assay komèt pa ka discrete. Yo sèvi kòm yon zouti esansyèl preliminè tès depistaj pou idantifye konpoze potansyèl jenotoksik. Rezilta yo nan analiz sa yo ka enfliyanse desizyon - fè pwosesis nan devlopman dwòg ak evalyasyon sekirite anviwònman an.Seleksyon nan selil ki apwopriye pou komèt assay
● Kalite selil yo itilize
Chwa a nan selil ka siyifikativman enpak rezilta a nan yon tès komèt. Selil yo itilize souvan gen ladan lenfosit, selil bukal, ak divès kalite liy selil kiltive. Chèchè yo souvan chwazi kalite selil ki baze sou objektif etid la ak fasilite pou jwenn echantiyon yo.● Konsiderasyon pou chwa selil
Lè w ap chwazi selil yo, konsidere faktè tankou disponiblite selil, sansiblite nan domaj ADN, ak enpòtans nan kesyon rechèch la. Pou egzanp, lenfosit yo fasil jwenn nan san epi yo sansib a ajan jenotoksik, fè yo yon chwa ekselan pou etid anpil.● Enpak sou rezilta tès yo
Orijin lan ak eta nan selil yo kapab afekte nivo debaz la nan domaj ADN ak repons selil la nan tretman yo. Se poutèt sa, konsistan seleksyon selil ak pwotokòl manyen yo kritik jwenn rezilta serye ak repwodwi nan assay komèt.Preparasyon nan jèl agarose
● Kalite agarose pou itilize
Chwazi agaroz la dwa enpòtan anpil pou entegrite nan nan komèt la. Se ba k ap fonn agarose pi pito paske li solidifye rapidman epi minimize domaj ADN pandan pwosesis la. Segondè - bon jan kalite agarose soti nan founisè bon repitasyon, tankou sa yo ki soti nan yon fè konfyans komèt tès glise founisè oswa komèt tès manifakti glise, se rekòmande.● Agarose konsantrasyon ak etap preparasyon
Tipikman, yo itilize yon konsantrasyon agarose ki ba 1% ki ba. Fonn agarose a nan yon zòn de defans apwopriye, chofe li jouk konplètman fonn, ak Lè sa a, fre nan yon tanperati ki san danje pou selilè selilè. Asire agaroz la gratis nan bul ak debri pou fè pou evite zafè nan tès la.● asire bon jan kalite jèl optimal
Bon jan kalite a nan jèl la agarose ka enfliyanse sansiblite épreuves a ak repwodibilite. Bon teknik manyen ak preparasyon yo esansyèl pou pwodwi yon jèl omojèn ak pwopriyete ki konsistan nan tout glisad diferan. Sa a asire ke fòmasyon komèt yo ak vizyalizasyon yo inifòm.Sispansyon selil ak selil entegre nan agarose
● Prepare sispansyon selil la
Kòmanse pa jwenn yon sèl - sispansyon selil. Pou selil kiltive, sa a enplike nan trypsinization, ki te swiv pa netralize ak lave. Pou selil prensipal tankou lenfosit, santrifigasyon ak resuspension nan yon zòn de defans apwopriye yo nesesè. Sèvi ak yon emositomèt pou asire yon konsantrasyon selil apeprè 1 x 10^5 selil/ml.● Selil embedding nan agarose pwen ki ba k ap fonn
Melanje sispansyon an selil ak pre - chofe ki ba k ap fonn agarose pwen nan yon rapò ki asire yon distribisyon inifòm nan selil yo. Rapidman pipèt melanj lan sou pre - kouvwi komet glisad, ki ka achte nan men yon faktori komèt tès komèt oswa yon founisè serye. Sèvi ak yon coverlip gaye agarose a respire ak anpeche bul lè.● gaye selil sou glisad
Yon fwa yo gaye agaroz la, pèmèt glisad yo refwadi ak solidifye sou yon sifas frèt oswa zòn nan frijidè. Etap sa a dwe fèt avèk efikasite pou anpeche agaroz la soti nan anviwònman, sa ki kapab afekte vizyalizasyon komèt pandan analiz yo.Lysis nan selil sou glisad yo
● Konpozisyon solisyon lysis
Solisyon lysis la tipikman gen gwo konsantrasyon sèl ak detèjan, tankou NaCl, EDTA, ak Triton X - 100, nan efektivman lyse selil yo epi retire manbràn ak pwoteyin pandan y ap kite ADN la entak.● Pwosedi lysis ak kondisyon
Plonje glisad yo nan solisyon an lysis ak enkubate nan 4 ° C pou omwen 1 èdtan, menm si enkubasyon lannwit lan souvan pi pito. Asire tank lysis la kouvri pou evite evaporasyon ak kontaminasyon. Kondisyon yo nan etap la lys yo kritik pou retire elektè selilè san yo pa degrade ADN lan.● Enpòtans lysis selil konplè
Enkonplè lysis ka rezilta nan fòmasyon komèt pòv ak done enfidèl. Se poutèt sa, li esansyèl yo swiv pwotokòl la lysis délikatès, asire solisyon an Penetration tout pati nan glise a ak ki fwa enkubasyon yo ase pou dezòd selil konplè.Alkalin dewoulman ak kondisyon elèktroforèz
● Preparasyon solisyon asid la
Se solisyon an asid, souvan yon melanj de NaOH ak EDTA, yo itilize detant ADN lan. Preparasyon li yo ta dwe fè ak anpil atansyon, asire pH ki kòrèk la ak molarite. Frèch prepare solisyon an yo kenbe efikasite li yo.● alkalin enpòtans ak tan
Enkubate glisad nan solisyon an alkalin, tipikman pou 20 - 40 minit, yo ki pèmèt seksyon yo ADN detant. Etap sa a se kritik pou detekte sèl - Strand repo ak alkali - sit labile. Optimize tan dewoulman ki baze sou pwotokòl espesifik ou ak kalite selil.● Enstalasyon elèktroforèz ak paramèt
Mete kanpe tank la elèktroforèz ak yon tanpon frèt elèktroforèz alkalin. Mete glisad yo nan tank la, asire yo konplètman submerged. Aplike yon vòltaj ki konsistan (anjeneral alantou 25 V) pou 20 - 30 minit. Kondisyon yo elèktroforèz, ki gen ladan vòltaj ak tan, yo dwe optimisé reyalize pi bon rezolisyon an nan migrasyon ADN.Netralize ak pwosesis tach
● Preparasyon tanpon netralizasyon ak itilize
Apre elèktroforèz, netralize glisad yo pou yo sispann reyaksyon an epi estabilize ADN lan. Yon tanpon netralizasyon komen gen baz Tris nan yon pH nan 7.5. Dousman rense glisad yo nan tanpon sa a plizyè fwa yo retire tout tras nan solisyon an asid.● Teknik tach
Tache glisad yo netralize ak yon ADN fliyoresan - lank obligatwa, tankou bromid etidyom oswa SYBR vèt. Bromid etidyom, pandan y ap klasik, mande pou manyen atansyon akòz pwopriyete mutagèn li yo. SYBR Green ofri yon altènatif pi an sekirite ak gwo sansiblite. Enkubate glisad yo nan solisyon an tach pou yon tan ki apwopriye (anjeneral 15 - 30 minit) nan fè nwa a.● Vizyalizasyon komèt ADN
Apre tach, rense glisad yo dousman yo retire depase tach. Egzamine glisad yo anba yon mikwoskòp fluoresans. Bon jan kalite a nan tach la ak rezolisyon mikwoskòp la yo kritik pou jwenn imaj klè nan komèt yo.Mikroskopi ak analiz imaj
● Chwazi mikwoskòp la dwa
Yon mikwoskòp fluoresans ekipe ak yon seri filtre ki apwopriye ki nesesè pou visualizing ADN tache. Chwazi yon mikwoskòp ak rezolisyon segondè ak yon sistèm kamera ki kapab kaptire imaj detaye nan komèt yo.● Kaptire segondè - imaj bon jan kalite
Kaptire imaj nan omwen 50 komèt pou chak glise asire siyifikasyon estatistik. Asire menm ekleraj ak konsantre pou fè pou evite zafè. Bon kalibrasyon nan mikwoskòp la ak anviwònman kamera ka anpil amelyore kalite imaj.● Lojisyèl pou analiz komèt
Plizyè pwogram lojisyèl ki disponib pou analiz komèt, tankou CometScore ak CASP. Pwogram sa yo mezire paramèt tankou longè ke, entansite ke, ak moman ke, ki se kritik pou quantification domaj ADN.Depanaj pwoblèm komen
● Pwoblèm komen
Pwoblèm komen nan assay komèt gen ladan segondè fluoresans background, fòmasyon komèt ki ba, ak rezilta konsistan ant glisad. Pwoblèm sa yo ka sòti nan divès sous, ki gen ladan manyen selil pòv, preparasyon jèl suboptimal, ak lysis kòrèk oswa kondisyon elèktroforèz.● Solisyon ak mezi prevantif
Pou diminye gwo fluoresans background, asire ke tout reyaktif ak jèl yo gratis nan kontaminan. Pou fòmasyon komèt ki ba, verifye ke viabilité selil la wo, ak kondisyon lys yo pi bon. Preparasyon glise konsistan ak aderans pwotokòl apwofondi yo se mezi prevantif kle.● Asire repwodiksyon ak presizyon
Atenn repwodiksyon nan assay komèt mande pou strik pwotokòl normalizasyon ak validation regilye nan chak etap. Regilyèman detèmine ekipman, sèvi ak segondè - reyaktif bon jan kalite, epi kenbe dosye detaye sou tout kondisyon eksperimantal asire presizyon.Done entèpretasyon ak rezilta rapò
● Analize paramèt ke komèt
Paramèt kle pou quantification domaj ADN gen ladan longè ke, ki reflete limit la nan migrasyon ADN, ak entansite ke, ki vle di kantite lajan an nan ADN nan ke la. Moman sa a ke oliv, yon mezi konpoze, se tou souvan itilize.● Konsiderasyon estatistik nan rapò done yo
Egzat analiz estatistik se esansyèl pou entèpretasyon done. Sèvi ak tès apwopriye estatistik yo konpare nivo domaj ADN ant gwoup echantiyon diferan. Asire ke done ki sòti nan glisad miltip ak eksperyans yo pisin nan kont pou variation.● Prezante ak entèprete rezilta yo
Prezante rezilta ou yo nan yon fason ki klè ak kout, lè l sèvi avèk graf ak tab ilistre rezilta kle yo. Diskite sou enplikasyon nan nivo yo domaj ADN obsève ak enpak la potansyèl sou sistèm nan byolojik anba etid.KONKLIZYON: Atenn segondè - bon jan kalite komèt glisad
Preparasyon segondè - bon jan kalite komet glisad enplike nan konsiderasyon atansyon nan seleksyon selil, preparasyon jèl agarose, kondisyon lysis, elèktroforèz, tach, ak analiz imaj. Chak etap yo dwe délikatès optimisé ak estanda asire rezilta serye ak repwodwi. Kolabore ak Swèd Slide Slide Repitasyon Kometabl ak manifaktirè ka amelyore bon jan kalite a nan épreuves ou pa bay segondè - materyèl klas ak sipò teknik.● souIphaseByosyans
Biwo santral li nan North Wales, Pennsylvania, iPhase Biosciences se yon "espesyalize, roman, ak inovatè" High - Tech Enterprise entegre rechèch, devlopman, pwodiksyon, lavant, ak sèvis teknik nan réactifs inovatè byolojik. Ogmante anpil konesans ak pasyon pou rechèch syantifik, ekip syantifik nou an ki gen plis pase 50 ekspè ki gen eksperyans angaje nan bay bon jan kalite inovatè réactifs byolojik syantis yo atravè lemond ak ede chèchè nan tout inisyativ syantifik yo ede reyalize objektif rechèch yo. Kouri dèyè ideyal R&D nan "réactifs inovatè, fè rechèch sou lavni an", iPhase etabli miltip R & D enstalasyon, sant lavant, depo, ak patnè distribisyon nan Etazini yo, Ewòp, ak peyi lès Azyatik - ki kouvri plis pase 12,000 mèt kare.Post tan: 2024 - 08 - 28 14:05:21