Fraksi S9 Hati Tikus yang Diinduksi: Sistem Aktivasi Metabolik untuk Tes Genotoksisitas dan Mutasi In Vitro

Kata kunci: OECD 471, OECD 473, OECD 476, OECD 487, Mutation Test, Genotoxicity, Genetic Toxicity, Induced Rat Liver S9, Ames Test, Mini Ames Test, Chromosomal Aberration, Micronucleus, HPRT/HGPRT Assay, TK Assay

Produk iPhase

Perkenalan

Hati tikus yang diinduksi S9adalah komponen utama dalam menilaiToksisitas genetikPotensi bahan kimia, terutama dalam toksikologi peraturan. Ini biasanya digunakan dalam kombinasi dengan uji in vitro, sepertiTes Ames Dantes mutasi, untuk mengevaluasi sifat mutagenik senyawa. Dengan menyediakan sistem enzimatik yang kaya sitokrom P450 (CYP450), fraksi hati tikus yang terinduksi memainkan peran penting dalam mensimulasikan proses metabolisme yang terjadi di hati, membantu menentukan apakah bahan kimia berpotensi menyebabkan mutasi genetik atau kanker.

Hati tikus yang diinduksi S9

Fraksi hati S9 mengacu pada supernatan mitokondria post - yang diperoleh dari homogenat hati tikus setelah serangkaian langkah sentrifugasi. Istilah "diinduksi" mengacu pada pengobatan tikus dengan senyawa spesifik yang meningkatkan aktivitas enzim hati, terutama enzim sitokrom P450 (CYP450), yang bertanggung jawab atas metabolisme berbagai xenobiotik.

Fraksi S9 hati tikus yang diinduksi mengandung berbagai enzim yang terlibat dalam metabolisme bahan kimia fase I dan fase II. Ini termasuk enzim seperti sitokrom P450 monooxygenases, yang memfasilitasi biotransformasi oksidatif dari substrat, sehingga meniru metabolisme hati manusia.

Aktivitas CYP450 dan aktivasi metabolisme

Keluarga enzim sitokrom P450 (CYP450) memainkan peran penting dalam metabolisme berbagai zat, termasuk banyak obat -obatan, bahan kimia lingkungan, dan karsinogen. Fraksi S9 hati tikus yang diinduksi mengandung enzim ini dan sangat penting untuk mengevaluasi bahan kimia yang hanya dapat menjadi genotoksik setelah aktivasi metabolisme.

Banyak senyawa pada awalnya tidak beracun tetapi dapat menjadi racun setelah metabolisme di hati. Pro - mutagens ini (yang membutuhkan aktivasi metabolisme menjadi mutagenik) dan karsinogen Pro - (yang membutuhkan aktivasi untuk menyebabkan kanker) hanya dapat dideteksi melalui pengujian yang mencakup sistem aktivasi metabolisme S9. Tanpa induksi enzim metabolik seperti CYP450, zat -zat ini mungkin tampak tidak berbahaya dalam tes genotoksisitas standar.

Dengan menambahkan hati tikus yang terinduksi ke uji in vitro, para peneliti dapat menilai bagaimana suatu zat berinteraksi dengan enzim CYP450. Ini sangat penting untuk obat -obatan, karena metabolisme oleh enzim CYP450 adalah langkah penting dalam farmakokinetik banyak obat.

Aplikasi Hati Tikus yang Diinduksi S9

1. 1. Tes Ames (OECD 471)

Tes Ames, diuraikan dalam pedomanOECD 471, adalah salah satu metode yang paling diketahui dan banyak digunakan untuk menilai mutagenisitas. Ini melibatkan mengekspos strain bakteri Salmonella ke bahan kimia uji untuk melihat apakah ia menginduksi mutasi yang menyebabkan bakteri kembali ke keadaan independen histidin -

Untuk mensimulasikan proses metabolisme manusia, hati tikus yang diinduksi S9 sering ditambahkan ke sistem uji. Fraksi S9 menyediakan enzim yang diperlukan, termasuk CYP450, yang mungkin diperlukan untuk memetabolisme senyawa menjadi bentuk yang lebih reaktif yang dapat menyebabkan mutasi pada DNA bakteri. Kombinasi S9 ini dengan uji AMES memungkinkan penilaian potensial mutagenik yang lebih komprehensif dengan meniru mekanisme mutagenik langsung dan diaktifkan secara metabolik.

2. 2.Tes mutasi (uji penyimpangan kromosom, uji mikronukleus, dan uji in vitro lainnya)

Selain uji AMES, tes mutasi biasanya digunakan untuk mengevaluasi potensi genotoksik bahan kimia. Tes -tes ini lebih komprehensif dalam menilai berbagai kerusakan genetik, termasuk mutasi kromosom, mutasi gen, dan pembentukan micronuclei. Hati tikus yang diinduksi S9 digunakan dalam tes mutasi karena alasan berikut:

Tes Micronucleus (OECD 487)

Tes ini mendeteksi pembentukan micronuclei dalam sel, yang kecil, benda ekstranuklear yang mengandung fragmen kromosom atau seluruh kromosom yang belum dimasukkan ke dalam nukleus selama pembelahan sel. Itu Tes Micronucleusdapat mendeteksi efek klastogenik (kromosom - Breaking) dan aneugenik (mempengaruhi jumlah kromosom). S9 hati tikus yang diinduksi digunakan di sini untuk mengaktifkan zat uji secara metabolik, karena beberapa bahan kimia hanya menyebabkan kerusakan kromosom setelah mereka dimetabolisme oleh enzim hati. Fraksi S9 meningkatkan sensitivitas tes dengan mensimulasikan aktivasi metabolisme yang mungkin terjadi in vivo.

Tes penyimpangan kromosom (OECD 473)

Tes ini mengevaluasi apakah suatu zat dapat menyebabkan kerusakan struktural kromosom dengan menginduksi istirahat, penghapusan, translokasi, atau jenis penyimpangan lainnya. Seperti tes micronucleus,Tes penyimpangan kromosomdapat diterapkan dengan atau tanpa aktivasi metabolisme. S9 hati tikus yang diinduksi ditambahkan ke sistem uji untuk meniru proses metabolisme di hati, memungkinkan penilaian zat yang mungkin tidak menyebabkan kerusakan kromosom dalam bentuk aslinya tetapi dapat melakukannya setelah metabolisme hati.

Tabel 1. Pertimbangan komparatif dari tes mutasi

HPRT/HGPRT USAY (OECD 476)

DiUji HPRT/HGPRT, kultur sel Hamster Cina (CHO atau V79) atau sel limfoblastoid manusia (TK6) terpapar pada bahan kimia uji dengan adanya campuran metabolik hati S9 tikus yang diinduksi, yang memasok enzim CYP450 yang diperlukan untuk mengubah pro -mutagen menjadi spesies DNA -reaktif. Setelah perawatan singkat dan periode ekspresi tujuh hari, sel -sel ditantang dengan 6 -thioguanine; Hanya klon yang mengandung mutasi kerugian -fungsi pada gen hipoksantin -guanin fosforibosiltransferase yang bertahan hidup. Dengan membandingkan jumlah koloni mutan dengan viabilitas secara keseluruhan, para peneliti menentukan frekuensi mutasi bahwa, jika secara reproduksi meningkat pada kontrol bersamaan dan historis, menunjukkan potensi genotoksik.

TK Tes (OECD 490 & OECD 476)

ItuUji tk menggunakan sel limfoma tikus L5178Y (OECD 490) atau sel CHO (OECD 476) Rekayasa heterozigot di lokus timidin kinase. Setelah paparan kimia ± campuran S9, sel -sel pulih dan dilapisi dalam medium yang mengandung trifluorothymidine, yang membunuh sel -sel yang berprofisi TK. Mutan TK⁻ yang selamat membentuk koloni selama 10-14 hari, dengan mutan koloni kecil sering mencerminkan peristiwa kromosom dan mutan koloni besar yang mencerminkan mutasi titik. Seperti dalam uji HPRT/HGPRT, kontrol sitotoksisitas yang ketat dan tolok ukur mutagen positif memastikan bahwa peningkatan frekuensi mutasi yang diamati dengan andal mencerminkan risiko genotoksik suatu senyawa.

4. 4. Penilaian Risiko Kanker

Hati tikus yang diinduksi S9 juga digunakan dalam penelitian yang bertujuan menilai kanker - yang menyebabkan potensi zat. Dengan mensimulasikan proses metabolisme yang terjadi di hati manusia, fraksi S9 dapat membantu mengidentifikasi senyawa yang dapat menyebabkan pembentukan metabolit reaktif yang mampu mengikat DNA dan menyebabkan mutasi yang dapat menyebabkan kanker.

Tes AMES yang ditingkatkan dengan hati hamster yang diinduksi S9

Menurut pedoman terbaru yang dikeluarkan oleh Badan Obat Eropa (EMA), tes AMES tradisional mungkin tidak cukup sensitif untuk mendeteksi potensi mutagenik dari kotoran n - nitrosamin tertentu, terutama n - nitrosodimethylamine (NDMA), antara lain. Oleh karena itu, tes AMES yang ditingkatkan, yang dikembangkan oleh Pusat Nasional untuk Penelitian Toksikologi (NCTR), sebuah pembagian Administrasi Makanan dan Obat -obatan AS (FDA), telah direkomendasikan sebagai alternatif yang lebih andal. Tes AMES yang ditingkatkan memperkenalkan penambahan hati hamster yang diinduksi S9, yang dilakukan dalam mengandung 30% hati tikus S9 dan 30% hati hamster S9. Supernatan desmosom tikus dan hamster (S9s) harus disiapkan dari hati tikus yang diobati dengan sitokrom P450 enzim - menginduksi zat. Dengan menggunakan hati hamster yang diinduksi S9, tes yang ditingkatkan ini lebih baik mensimulasikan metabolisme manusia dan meningkatkan keandalan hasil.

Kesimpulan

S9 hati tikus yang diinduksi berfungsi sebagai alat penting dalam pengujian genotoksisitas, membantu para peneliti dan lembaga pengatur menilai potensi bahan kimia mutagenik dan karsinogenik. Dengan menyediakan sistem aktivasi metabolisme, ini meningkatkan kemampuan pengujian seperti tes AMES, tes mutasi, dan studi aktivitas CYP450 untuk mendeteksi zat yang membutuhkan aktivasi metabolisme menjadi genotoksik. Aplikasinya sangat penting untuk memastikan keamanan obat baru, bahan kimia, dan produk konsumen. Dengan perannya dalam mensimulasikan metabolisme hati manusia, fraksi hati tikus yang diinduksi terus menjadi bagian yang sangat diperlukan dari toksikologi modern dan penilaian keselamatan peraturan.