Sp .: Hvernig ætti ég að velja smásjá og lifrarfrumur fyrir rannsóknir á efnaskiptum stöðugleika? Get ég valið aðeins einn þeirra til að uppfylla kröfuna?
A: Í efnaskipta stöðugleikarannsókn fer val á lifrarspeglum eða lifrarfrumum aðallega á efnaskiptaeiginleika efnasambandanna, þar sem sá sem er með hátt efnaskiptahraða er valinn. Almennt eru lifrar smásjár ákjósanleg, sérstaklega þegar samsetningarsameindirnar eru meira vatn - leysanlegar og eitt - fasa umbrot er aðal efnaskiptaferillinn (sérstaklega með CYP). Nota má lifrarfrumur við tilraunir þegar vísbendingar eru um tvö - fasa umbrot sem aðalleiðina, vatnsrof sem aðal efnaskiptaferilinn, mikið ósértækt próteinbinding í lifrarsmíkróm og efnaskipti í lifrarspeglum er ekki áberandi. Venjulega er hægt að velja eitt efnaskiptakerfi til að mæta þörfum; Ef skilyrðin í öllum þáttum leyfa er örugglega best að velja bæði kerfin á sama tíma.
Sp .: Af hverju er nauðsynlegt að nota aðal lifrarfrumur til örvunargreiningar ensíma?
A: CYP ensím - framkallað próf þarf að fara frá „umritun“, „þýðingu“ yfir í „POST - Translational breyting á próteini“ til að fá virkt CYP ensímprótein. Þess vegna ætti prófkerfið að vera lifrarfrumur, ekki lifrarsmíkróm eða lifur S9.
Sp .: Af hverju þarf ég að velja þrjá aðal lifrarfrumur í mönnum fyrir ensím örvunarpróf?
A: Samkvæmt kynningu á leiðbeiningum um milliverkanir við lyfjum ætti að nota að minnsta kosti þrjá gjafa og meta ætti örvunarárangur hvers gjafa sérstaklega. Auk þess að framleiða tölfræðilega marktækar niðurstöður er val þriggja gjafa fyrir tilraunina einnig mikilvægara til að meta inter - einstaklingsbreytingu. Ef niðurstaðan frá að minnsta kosti einum gjafa fer yfir fyrirfram ákveðinn þröskuld, getur lyfjaframbjóðandinn verið framkallaður og fylgst er með upp á mati.
Sp .: Af hverju að einbeita sér aðeins að örvun CYP ensíms og ekki á framköllun UGT ensíms?
A: Ástæðan fyrir því að einbeita sér að örvun CYPase er sú að fyrirkomulag örvunar CYPase hefur verið rannsökuð með skýrari hætti. Með öðrum orðum, ástæðan fyrir því að þurfa ekki rannsókn á framköllun Ugtase er sú að gangverkið er enn óljóst; En það þýðir ekki að Ugtase verði ekki framkallaður. Í leiðbeiningunum kemur einnig fram að það er ekkert staðlað flokkunarkerfi fyrir örvun eða hemla flutningsmanna og II. Stigs umbrotsensím.
Sp .: Hve lengi getur viðloðandi aðal lifrarfrumur lifað eftir endurlífgun og hversu lengi er hægt að viðhalda lifrarfrumum án viðloðandi menningar eftir endurlífgun?
A: Pasteurized aðal lifrarfrumur eru almennt notuð við örvunargreiningar ensíma. Eftir endurheimt frumna eru frumur sviflausnar í plötudreifandi miðli, aðlagaðar að viðeigandi styrk og ræktaðar í kollageni - húðuðum plötum; Þá er hægt að gera gerilsneyddar innan 4 ~ 6 klukkustunda. Eftir að frumurnar eru festar við vegginn er viðhaldsmiðlinum skipt út og viðhaldið í 18 klst. Til að tryggja hámarks endurreisn frumuástands. Næst er hægt að framkvæma örvunargreiningu ensíma til að greina efnaskiptavirkni og mRNA örvunarstig. Frá sjónarhóli allrar hringrásarinnar er hægt að viðhalda lifrarfrumum í 6 ~ 7 daga eftir að veggfest er. Eftir því sem tíminn líður versnar frumuveggsástandið og frumurnar losna og fresta.
Ef viðloðandi lifrarfrumur eru ekki ræktaðar höfum við staðfest að hægt sé að viðhalda þeim í góðu ástandi innan 4 ~ 6 klukkustunda. Við höfum ekki enn framkvæmt sannprófun í lengri tíma.
Sp .: Hægt er að nota lifrarfrumur sem bæði sviflausn og viðloðandi frumur eftir mismunandi ræktunarmiðli sem notaður er?
A: Flestar frumur úr föstum vefjum og líffærum eru múraðar, en ekki eru allar frumur múraðar þegar þær eru ræktaðar í - vitro. Hvort frumurnar eru vegg - viðloðandi eða ekki fer eftir ástandi frumna; Á sama tíma þurfa Wall - viðloðandi frumur sértækan ræktunarmiðil og nokkur sérstök viðloðunarefni frumna (t.d. rhamnogelinogen, laminin, fibronectin, stækkunarstuðull í sermi) sem getur tekið þátt í því ferli frumufestingar. Að lokum er hægt að nota viðloðandi frumur sem fjöðrarfrumur, en sviffrumur eru ekki endilega tiltækar til notkunar.
Sp .: Hverjir eru kostir/gallar við að nota viðloðandi veggsvers sviflausn lifrarfrumur? Hver eru ákvörðunarviðmiðin?
A: Eftir að lifrarfrumur eru einangraðar er hægt að rækta þau í fjöðrun eða í viðloðandi vegg. Virkni cýtókróm P450 ensíms frá sviflausn ræktað aðal lifrarfrumur er mest í samræmi við það sem í - vivo fyrstu 4 ~ 6 klst., Fækkar síðan hratt með lengingu tímans. Þess vegna eru lifrarfrumur í fjöðrun almennt notaðar við rannsókn á efnaskiptum eða rannsóknum á umbrotsefnum. Aðal lifrarfrumur sem ræktaðar eru í viðloðandi vegg hafa nægan tíma til að jafna sig eftir skemmdir til að viðhalda líffræðilegum einkennum og efnaskiptavirkni eðlilegra lifrarfrumna. Þess vegna eru þeir almennt notaðir við rannsóknir á örvunar ensímum, rannsóknir á frumudrepandi eituráhrifum, efnaskipta stöðugleika hægra umbrotslyfja eða rannsóknir á afurða á vöru.
Sem stendur bjóðum við ekki upp á vefsíðu á netinu kaupþjónustu. Vörurnar bætt við innkaupakörfuna eftir skráningu og innskráningu eru eingöngu til viðmiðunar. Ef þú þarft að kaupa vörur okkar, vinsamlegast láttu tengiliðaupplýsingarnar þínar í gegnum sambandsrásina og við munum hafa samband í tíma til að ljúka þjónustu okkar.
Sp. ： Hvernig hefur non - sértæk próteinbinding áhrif á niðurstöður prófsins?
A ： Ef lyfjaframbjóðandinn binst ekki - Sérstaklega við smásjárprótein, leiðir þetta til breyttra hreyfiorka. Þegar styrkur próteins eykst eykst KM gildi, sem leiðir til lítillar áformaðrar eðlislægrar úthreinsunar. Einnig getur binding lyfjaframbjóðandans við prótein í smásjáum leitt til mikils breytileika á niðurstöðum frá mismunandi rannsóknarstofum og mismunandi kerfum.
Q ： Ráðlagður styrkur lifrar smásjárpróteins í leiðbeiningarhandbókinni um stig I eða II. Stigs efnaskipta stöðugleikabúnað er 0,1 mg/ml - 1 mg/ml, þýðir það að þegar það er notað lifrarsmíkrós er samt nauðsynlegt að þynna þá vel áður en þeir eru bætir við kerfinu?
A: Það er engin þörf á að þynna lifrar smásjárnar fyrst; Styrkur lifrar smásjár í búnaðinum er 20 mg/ml og lokastyrkur lifrar smásjár í prófkerfinu er 0,1 - 1 mg/ml, sem hægt er að bæta við hlutfallslega.
Sp. ： Hver er ráðlagður frumuþéttleiki fyrir efnaskipta stöðugleikapróf á aðal lifrarfrumum? Er úthreinsunarútreikningurinn sá sami og fyrir lifrar smásjár?
A ： Ráðlagður frumuþéttleiki fyrir aðal lifrarfrumu efnaskipta stöðugleika er 0,5 til 2 × 106 Frumur/ml, og útreikningar á úthreinsun og vinnsla niðurstaðna á örveru stöðugleika í lifrarþéttni eru í samræmi.
Sp. ： Hver eru aðal innihaldsefnin í PBS stuðpúðanum þínum? Inniheldur það KCl og NaCl?
A ： Helstu þættir PBS stuðpúðarins okkar eru K2HPO4 og KH2PO4, og eru laus við KCl og NaCl.
Sp. ： Hver er tilgangur fosfatjafnalausra? Af hverju þarftu fosfat?
A ： Fosfatjafnalausir eru valdir í tilgangi sínum að líkja eftir lífeðlisfræðilegu umhverfi og fosfat er eitt mikilvægasta biðminni til að viðhalda vökvaumhverfi líkamans.
Sp. ： Hver er venjuleg stilling fyrir ensím - framkallaður viðtakaþéttni? Er einhver lausn ef leysni kerfisins sem á að prófa er léleg?
Setja þarf upp á ensím örvunargreiningunni með 3 mismunandi styrk, styrkleiki þarf að hylja áætlaðan árangursríka blóðlyf hjá mönnum og hæsti styrkur er valinn að vera að minnsta kosti ein stærðargráðu hærri en meðaltals árangursríkt blóðstyrk hjá mönnum. Ef leysni í vatnsfasanum er léleg, er hægt að velja lífrænan leysingu sem leysi hans, t.d. Stjórna þarf DMSO, en það þarf að stjórna magni lífræns leysi sem bætt er við kerfið.
Spurning ： Í rannsóknum á efnaskiptum stöðugleika, er það nauðsynlegt að nota tvö prófkerfi, lifrar smásjár og aðal lifrarfrumur, til að prófa?
A ： Smásjá í lifur eru næstum kúlulaga himnablöðru - eins og mannvirki sem myndast af sjálfinu - samruna sundurlausrar endoplasmic reticulum sem fengin voru við einsleitni og mismunadreifingu á lifrarvefjum, og innihalda CYP450 ensím og nokkur bífasísk ensím, E.G., UGts, STS. Aðal lifrarfrumur (PHC) eru lifrarfrumur ræktaðar strax eftir beina einangrun frá dýra lifur, sem í grundvallaratriðum viðhalda efnaskiptaaðgerðum lifrarinnar, sérstaklega betur að varðveita ensímmagnið í samræmi við þá in vivo. Í rannsókninni á efnaskipta stöðugleika er engin þörf á að huga að kostnaði og hægt er að velja tvö prófkerfi fyrir prófið á sama tíma; eða hægt er að velja viðeigandi prófunarkerfi í samræmi við efnaskiptaeiginleika efnasambandsins og meginreglan er sú hvaða kerfið hefur hátt efnaskiptahraða er valið. Almennt eru lifrar smásjár besti kosturinn þegar samsettu sameindirnar eru meira vatn - leysanlegar og eitt - fasa umbrot er aðal efnaskiptaferillinn (sérstaklega með CYP); Þegar tvö - fasa umbrot er aðalleiðin er vatnsrofi aðal efnaskiptaferillinn, ekki - sértæk próteinbinding í lifrarsmíkjunum er mjög mikil og umbrot er ekki augljóst í lifrarsmíkjunum er hægt að framkvæma prófið með aðal lifrarfrumum.
Sp. ： Er styrkur smásjár sem skoðaður er í efnaskipta stöðugleikaprófinu? Hvaða áhrif eru of mikil eða of lág?
A ： Í efnaskipta stöðugleikaprófinu mun próteinstyrkur einnig hafa áhrif á efnaskiptahraða, venjulega velja smásjárpróteinstyrk 0,1 mg/ml ~ 1 mg/ml, sértækt val á því hversu mikið próteinstyrk ætti að vera valin í samræmi við eigin efnaskipta eiginleika efnasambandsins. Of mikill styrkur smásjárpróteins mun leiða til þess að lyfið er ekki - sértæk binding lyfsins við smásjárprótein; Þó að of lítill styrkur smásjárpróteins geti leitt til óverulegs umbrots lyfsins.