FAQ

D: Come dovrei scegliere microsomi ed epatociti per studi di stabilità metabolica? Posso scegliere solo uno di loro per soddisfare il requisito?

A: Nello studio di stabilità metabolica, la scelta dei microsomi epatici o degli epatociti dipende principalmente dalle proprietà metaboliche dei composti, in cui viene scelta quella con un alto tasso metabolico. In generale, sono preferiti i microsomi epatici, specialmente quando le molecole composte sono più acqua - solubili e il metabolismo di una - fase è la principale via metabolica (specialmente tramite CYP). Gli epatociti possono essere usati per esperimenti quando vi sono prove del metabolismo di due - fasi come il percorso principale, l'idrolisi in quanto la principale via metabolica, non è evidente il legame proteico non specifico elevato nei microsomi epatici e il metabolismo nei microsomi epatici. Di solito, un sistema metabolico può essere scelto per soddisfare le esigenze; Se le condizioni in tutti gli aspetti consentono, è sicuramente meglio scegliere entrambi i sistemi contemporaneamente.

D: Perché è necessario utilizzare gli epatociti primari per il test di induzione enzimatica?

A: L'enzima CYP - dosaggio indotto deve passare dalla "trascrizione", "traduzione" a "post - modifica traslazionale della proteina" per ottenere una proteina enzimatica CYP attiva. Pertanto, il sistema di test dovrebbe essere cellule epatiche, non microsomi epatici o s9 epatico.

D: Perché devo scegliere tre epatociti primari umani donatori per il test di induzione enzimatica?

A: Secondo l'introduzione alle linee guida per le interazioni farmacologiche, dovrebbero essere utilizzati almeno tre donatori e il risultato di induzione di ciascun donatore dovrebbe essere valutato separatamente. Oltre a produrre risultati statisticamente significativi, la scelta di tre donatori per l'esperimento è anche più importante per la valutazione della variazione interagente. Se il risultato da almeno un donatore supera una soglia predeterminata, il candidato alla droga può essere inducibile e è richiesto la valutazione di seguito.

D: Perché concentrarsi solo sull'induzione dell'enzima CYP e non sull'induzione dell'enzima UGT?

A: La ragione per concentrarsi sull'induzione della cypase è che il meccanismo di induzione della cypase è stato studiato in modo più chiaro. In altre parole, la ragione per non aver richiesto lo studio dell'induzione dell'UGTase è che il meccanismo non è ancora chiaro; Tuttavia, ciò non significa che l'UGTase non verrà indotta. Le linee guida affermano inoltre che non esiste un sistema di classificazione standardizzato per induttori o inibitori degli enzimi del metabolismo di fase II.

D: Per quanto tempo possono sopravvivere gli epatociti primari aderenti dopo la rianimazione e per quanto tempo possono essere mantenuti gli epatociti senza cultura aderente dopo la rianimazione?

A: Gli epatociti primari pastorizzati sono generalmente utilizzati per i test di induzione enzimatica. Dopo il recupero delle cellule, le cellule sono sospese nel mezzo di diffusione della piastra, regolate alla concentrazione appropriata e coltivate in piastre rivestite con collagene - Quindi le cellule possono essere pastorizzate entro 4 ~ 6 ore. Dopo che le celle sono state attaccate alla parete, il mezzo di manutenzione viene sostituito e mantenuto per 18 ore per garantire il massimo ripristino dello stato cellulare. Successivamente, è possibile eseguire un test di induzione enzimatico per rilevare l'attività metabolica e il livello di induzione dell'mRNA. Dal punto di vista dell'intero ciclo, gli epatociti possono essere mantenuti per 6 ~ 7 giorni dopo l'adesione al muro. Col passare del tempo, lo stato di aderenza alla parete cellulare si deteriora e le cellule si staccano e sospenderanno.

Se gli epatociti aderenti non sono coltivati, abbiamo verificato che possono essere mantenuti in un buon stato entro 4 ~ 6 ore. Non abbiamo ancora effettuato la verifica per un periodo più lungo.

D: Gli epatociti possono essere usati sia come sospensione che come cellule aderenti a seconda dei diversi terreni di coltura utilizzati?

A: La maggior parte delle cellule di tessuti solidi e organi sono murate, ma non tutte le cellule sono murate se coltivate in - vitro. Se le cellule sono murate - aderenti o meno dipende dallo stato delle cellule stesse; Allo stesso tempo, le cellule a muro - aderenti hanno bisogno di un terreno di coltura specifico e alcune sostanze speciali di adesione delle cellule (ad esempio ramnogelinogeno, laminina, fibronectina, fattore di espansione sierica) che possono partecipare al processo di attaccamento cellulare. In conclusione, le cellule aderenti possono essere utilizzate come cellule di sospensione, ma le cellule di sospensione non sono necessariamente disponibili per l'uso aderente.

D: Quali sono i vantaggi/svantaggi dell'uso di epatociti a sospensione dei versi aderenti? Quali sono i criteri decisionali?

A: Dopo che gli epatociti sono isolati, possono essere coltivati ​​in sospensione o in parete aderente. L'attività dell'enzima del citocromo P450 dagli epatociti primari coltivati ​​in sospensione è più coerente con quella di in - vivo per i primi 4 ~ 6h, quindi diminuisce rapidamente con il prolungamento del tempo. Pertanto, gli epatociti a sospensione sono generalmente utilizzati per lo studio di stabilità metabolica o lo studio di profilazione dei metaboliti. Gli epatociti primari coltivati ​​nella parete aderente hanno tempo sufficiente per riprendersi da danni per mantenere le caratteristiche biologiche e l'attività metabolica dei normali epatociti. Pertanto, sono generalmente utilizzati per studi di induzione enzimatica, studi di citotossicità dei farmaci, stabilità metabolica di farmaci metabolizzanti lenti o studi di inferenza del prodotto.

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D ： In che modo il legame proteico non - non influisce sui risultati dei test?

A ： Se il candidato al farmaco si lega non - All'aumentare della concentrazione di proteina, aumenta il valore di KM, risultando in una bassa clearance intrinseca presunta. Inoltre, il legame del candidato al farmaco alle proteine ​​nei microsomi può comportare grandi variazioni nei risultati di diversi laboratori e sistemi diversi.

Q ： La concentrazione raccomandata della proteina microsomiale epatica nel manuale di istruzioni del kit di stabilità metabolica di fase I o di fase II è 0,1 mg/ml - 1 mg/mL, ciò significa che quando si usano i microsomi epatici, è ancora necessario diluirli bene prima di aggiungerli al sistema?

UN: Non è necessario diluire prima i microsomi epatici; La concentrazione di microsomi epatici nel kit è di 20 mg/mL e la concentrazione finale di microsomi epatici nel sistema di test è 0,1 - 1 mg/ml, che può essere aggiunta proporzionalmente.

D ： Qual è la densità cellulare raccomandata per i test di stabilità metabolica degli epatociti primari? Il calcolo del clearance è lo stesso dei microsomi epatici?

A ： La densità cellulare raccomandata per il test di stabilità metabolica dell'epatocita primaria è da 0,5 a 2 × 10⁶ Le cellule/ml e i calcoli di clearance e l'elaborazione dei risultati del test di stabilità metabolica microsomiale epatica sono coerenti.

D ： Quali sono gli ingredienti principali nel buffer PBS? Contiene KCL e NaCl?

A ： I componenti principali del nostro buffer PBS sono k₂HPO₄ e kh₂PO₄e sono liberi da KCL e NaCl.

D ： Qual è lo scopo dei tamponi fosfato? Perché hai bisogno di fosfato?

Un ： tamponi di fosfato sono scelti per il loro scopo di imitare l'ambiente fisiologico e il fosfato è una delle coppie tamponi più importanti per mantenere l'ambiente fluido del corpo.

D ： Qual è l'impostazione solita per la concentrazione di recettori indotta da enzimi - Esiste una soluzione se la solubilità del sistema da testare è scarsa?

A ： Il test di induzione enzimatico deve essere impostato con 3 diverse concentrazioni, il livello di concentrazione deve coprire la concentrazione di farmaci ematici efficaci previsti nell'uomo e la massima concentrazione è scelta per essere almeno un ordine di grandezza superiore alla concentrazione media del farmaco ematico nell'uomo. Se la solubilità nella fase acquosa è scarsa, un solvente organico può essere scelto come solvente, ad es. DMSO, ma la quantità di solvente organico aggiunto al sistema deve essere controllata.

D ： Negli studi di stabilità metabolica, è necessario utilizzare due sistemi di test, microsomi epatici ed epatociti primari, per i test?

A ： I microsomi epatici sono quasi sferici vescicole di membrana - Strutture simili formate dall'auto -fusione di reticolo endoplasmatico frammentato ottenuto durante l'omogeneizzazione e la centrifugazione differenziale di tessuti epatici e contengono enzimi del CYP450 e alcuni enzimi bifasici, ad esempio Ugts, ST. Gli epatociti primari (PHC) sono epatociti coltivati ​​immediatamente dopo l'isolamento diretto dai fegati animali, che sostanzialmente mantengono le funzioni metaboliche del fegato, in particolare preservando meglio i livelli di enzimi coerenti con quelli in vivo. Nello studio di stabilità metabolica, non è necessario considerare il costo e due sistemi di test possono essere selezionati per il test contemporaneamente; oppure il sistema di test appropriato può essere selezionato in base alle proprietà metaboliche del composto e il principio è quello che ha un sistema metabolico elevato. In generale, i microsomi epatici sono la scelta migliore quando le molecole composte sono più acqua - solubili e il metabolismo di una - fase è la principale via metabolica (specialmente tramite CYP); Quando il metabolismo di due - fase è la via principale, l'idrolisi è la principale via metabolica, il legame proteico non -

D ： La concentrazione di microsomi è esaminata nel test di stabilità metabolica? Qual è l'effetto troppo alto o troppo basso?

A ： Nel test di stabilità metabolica, la concentrazione proteica influenzerà anche il tasso metabolico, di solito scegli la concentrazione di proteina microsomiale di 0,1 mg/ml ~ 1 mg/mL, la scelta specifica di quanta concentrazione proteica dovrebbe essere selezionata in base alle proprietà metaboliche del composto. Una concentrazione troppo elevata di proteina microsomiale porterà a un legame non - mentre una concentrazione troppo bassa di proteina microsomiale può portare a metabolismo insignificante del farmaco.