ש: כיצד עלי לבחור במיקרוזומים והפטוציטים למחקרי יציבות מטבולית? האם אוכל לבחור רק אחד מהם כדי למלא את הדרישה?
ת: במחקר יציבות מטבולית, הבחירה במיקרוזומי כבד או הפטוציטים תלויה בעיקר בתכונות המטבוליות של התרכובות, בהן נבחר זה עם קצב מטבולי גבוה. באופן כללי, עדיפות מיקרוזומי כבד, במיוחד כאשר המולקולות המורכבות הן יותר מים - מסיסים ואחד - מטבוליזם שלב הוא המסלול המטבולי העיקרי (במיוחד באמצעות CYP). הפטוציטים עשויים לשמש לניסויים כאשר קיימות עדות לשני מטבוליזם של שלב כמסלול העיקרי, הידרוליזה כמסלול המטבולי העיקרי, קשירת חלבון לא ספציפית גבוהה במיקרוזומי כבד, ומטבוליזם במיקרוזומי כבד אינה מובנת. בדרך כלל ניתן לבחור מערכת מטבולית אחת כדי לענות על הצרכים; אם התנאים בכל ההיבטים מאפשרים, עדיף בהחלט לבחור את שתי המערכות בו זמנית.
ש: מדוע יש צורך להשתמש בהפטוציטים ראשוניים למבחן אינדוקציה של אנזים?
ת: אנזים CYP - מבחן המושרה צריך לעבור מ"תמלול "," תרגום "ל" POST - שינוי תרגומי של חלבון "כדי להשיג חלבון אנזים CYP פעיל. לפיכך, מערכת הבדיקה צריכה להיות תאי כבד, לא מיקרוזומי כבד או כבד S9.
ש: מדוע עלי לבחור שלושה הפטוציטים ראשוניים אנושיים תורמים למבחן אינדוקציה של האנזים?
ת: על פי המבוא להנחיות לאינטראקציות תרופות, יש להשתמש לפחות בשלושה תורמים, ויש להעריך את תוצאת האינדוקציה של כל תורם בנפרד. בנוסף לייצור תוצאות מובהקות סטטיסטית, הבחירה בשלושה תורמים לניסוי חשובה גם יותר להערכת וריאציה אינדיבידואלית. אם התוצאה של לפחות תורם אחד עולה על סף שנקבע מראש, המועמד לתרופות עשוי להיות מעורר וניתן לעקוב אחר הערכה.
ש: מדוע להתמקד רק בהשראת אנזים CYP ולא בהשראת אנזים UGT?
ת: הסיבה להתמקד בהשראת Cypase היא שמנגנון אינדוקציה של Cypase נחקר בצורה ברורה יותר. במילים אחרות, הסיבה לא לדרוש חקר אינדוקציה של UGTase היא שהמנגנון עדיין לא ברור; עם זאת, אין פירוש הדבר כי UGTase לא ייגרם. ההנחיות קובעות גם כי אין מערכת סיווג סטנדרטית למעוררי או מעכבים של אנזימי חילוף החומרים של המובילים ושלב II.
ש: כמה זמן יכולים הפטוציטים הראשוניים הדבקים לשרוד לאחר החייאה, וכמה זמן ניתן לשמור על הפטוציטים ללא תרבות דבקה לאחר החייאה?
ת: הפטוציטים ראשוניים מפוסטר משמשים בדרך כלל למבחני אינדוקציה של האנזים. לאחר התאוששות תאים, תאים מושעים במדיום התפשטות צלחות, מותאמים לריכוז מתאים, ומטורפים בצלחות מצופות קולגן - אז ניתן לפסטור תאים תוך 4 ~ 6 שעות. לאחר התאים מחוברים לדופן, מדיום התחזוקה מוחלף ומתוחזק במשך 18 שעות כדי להבטיח שיקום מרבי של מצב התא. בשלב הבא ניתן לבצע בדיקת אינדוקציה של אנזים כדי לאתר פעילות מטבולית ורמת אינדוקציה mRNA. מנקודת המבט של כל המחזור, ניתן לשמור על הפטוציטים במשך 6 ~ 7 ימים לאחר הדבקות בקיר. ככל שעובר הזמן, מצב ההדבקות בקיר התא מתדרדר, והתאים יתנתקו ויתעו.
אם ההפטוציטים הדבקים אינם מתורבתים, אימתנו שניתן לשמור עליהם במצב טוב תוך 4 ~ 6 שעות. טרם ביצענו אימות לתקופה ארוכה יותר.
ש: הפטוציטים יכולים לשמש כתאים מתלים והן תאים דבקים בהתאם לתקשורת התרבות השונה בה נעשה שימוש?
ת: מרבית התאים מרקמות ואיברים מוצקים הם מוקפים, אך לא כל התאים מוקפים כאשר הם מתורבתים במבחנה. בין אם התאים הם דביקים או לא תלויים במצב של התאים עצמם; במקביל, תאים דבקים בקיר - זקוקים למדיום תרבות ספציפי וכמה חומרים הדבקה של תאים מיוחדים (למשל, Rhamnogelinogen, Laminin, Fibonectin, Factor Serum) העשויים להשתתף בתהליך התקשרות תאים. לסיכום, תאים דבקים יכולים לשמש כתאי השעיה, אך תאי ההשעיה אינם בהכרח זמינים לשימוש דבקים.
ש: מהם היתרונות/החסרונות של השימוש בפסוקי קיר דבקים בהשעיית הפטוציטים? מהם קריטריוני ההחלטה?
ת: לאחר מבודדים הפטוציטים, ניתן לטפח אותם במתלים או בקיר דבק. הפעילות של אנזים ציטוכרום P450 מהשעיית הפטוציטים ראשוניים מתורבתים עולה בקנה אחד עם זה של in - vivo עבור 4 ~ 6h הראשונים, ואז יורדת במהירות עם התארכות הזמן. לפיכך, בדרך כלל משתמשים בהפטוציטים של השעיה למחקר יציבות מטבולית או מחקר פרופיל מטבוליטים. להפטוציטים ראשוניים המתורבתים בקיר דבק יש מספיק זמן להתאושש מנזק לשמירה על המאפיינים הביולוגיים והפעילות המטבולית של הפטוציטים תקינים. מכאן שהם משמשים בדרך כלל למחקרי אינדוקציה של אנזים, מחקרי ציטוטוקסיות תרופתיים, יציבות מטבולית של תרופות מטבוליזציה איטית או מחקרי הסקה של מוצרים.
נכון לעכשיו, אנו לא מספקים שירות רכישה מקוון של דף אינטרנט. המוצרים שנוספו לעגלת הקניות לאחר ההרשמה וההתחברות מיועדים להתייחסות בלבד. אם אתה צריך לקנות את המוצרים שלנו, אנא השאר את פרטי הקשר שלך דרך ערוץ צור קשר, ואנחנו ניצור איתך קשר בזמן כדי להשלים את השירותים שלנו.
ש ： איך קשירת חלבונים לא - לא - משפיעה על תוצאות הבדיקה?
A ： אם המועמד לתרופה נקשר לא - באופן ספציפי לחלבונים מיקרוסומליים, הדבר מביא לפרמטרים קינטיים משתנים. ככל שריכוז החלבון עולה, ערך ה- KM עולה, וכתוצאה מכך פינוי מהותי נמוך. כמו כן, כריכת המועמד לתרופות לחלבונים במיקרוזומים יכולה לגרום לשונות גדולות בתוצאות ממעבדות שונות ומערכות שונות.
Q ： הריכוז המומלץ של חלבון מיקרוזומלי בכבד במדריך ההוראות של ערכת היציבות המטבולית שלב I או שלב II הוא 0.1 מ"ג/מ"ל - 1 מ"ג/מ"ל, האם זה אומר שכאשר משתמשים במיקרוזומי כבד, עדיין יש צורך לדלל אותם היטב לפני הוספתם למערכת?
א: אין צורך לדלל תחילה את המיקרוזומים הכבד; ריכוז המיקרוזומים הכבד בערכה הוא 20 מ"ג/מ"ל והריכוז הסופי של מיקרוזומים כבד במערכת הבדיקה הוא 0.1 - 1 מ"ג/מ"ל, שניתן להוסיף באופן יחסי.
ש ： מהי צפיפות התאים המומלצת לבדיקת יציבות מטבולית של הפטוציטים הראשוניים? האם חישוב הפינוי זהה למיקרוזומי כבד?
A ： צפיפות התא המומלצת למבחן היציבות המטבולית הראשונית של הפטוציטים היא 0.5 עד 2 × 106 תאים/ML, וחישובי הפינוי ועיבוד תוצאות המבחן של היציבות המטבולית המיקרוסומלית הכבד הם עקביים.
ש ： מהם המרכיבים העיקריים במאגר PBS שלך? האם הוא מכיל KCL ו- NaCl?
A ： המרכיבים העיקריים של מאגר ה- PBS שלנו הם K2HPO4 ו- KH2PO4, והם נקיים מ- KCl ו- NaCl.
ש ： מה המטרה של מאגרי פוספט? למה אתה צריך פוספט?
מאגרי פוספט נבחרים למטרתם לחקות את הסביבה הפיזיולוגית, ופוספט הוא אחד מזוגות החיץ החשובים ביותר לשמירה על סביבת הנוזלים של הגוף.
ש ： מה ההגדרה הרגילה לאנזים - ריכוז קולטנים המושרה? האם יש פיתרון אם המסיסות של המערכת שתבדוק היא ירודה?
יש להקים את מבחן אינדוקציה של האנזים עם 3 ריכוזים שונים, רמת הריכוז צריכה לכסות את ריכוז התרופות היעילות הצפויות בבני אדם, והריכוז הגבוה ביותר נבחר להיות לפחות סדר גודל אחד גבוה יותר מהריכוז הממוצע של תרופת הדם בבני אדם. אם המסיסות בשלב המימי ירודה, ניתן לבחור ממס אורגני כממס שלו, למשל. DMSO, אך יש לשלוט על כמות הממס האורגני שנוסף למערכת.
ש ： במחקרי יציבות מטבולית, האם יש צורך להשתמש בשתי מערכות בדיקה, מיקרוזומי כבד והפטוציטים ראשוניים, לבדיקה?
מיקרוזומים כבד הם שלפוחית קרום כדורית כמעט - כמו מבנים שנוצרו על ידי העצמי - היתוך של רשת אנדופלזמה מקוטעת המתקבלת במהלך הומוגניזציה וצנטריפוגה דיפרנציאלית של רקמות כבד, ומכילות אנזימים CYP450 וכמה אנזיזים דו -פסיים, למשל, ugts, sts. הפטוציטים ראשוניים (PHCs) הם הפטוציטים המתורבתים מיד לאחר בידוד ישיר מכבדי בעלי חיים, אשר בעיקרם שומרים על התפקודים המטבוליים של הכבד, במיוחד שימור טוב יותר על רמות האנזים התואמות את אלה ב- vivo. במחקר היציבות המטבולית, אין צורך לשקול את העלות, וניתן לבחור שתי מערכות בדיקה למבחן בו זמנית; או שניתן לבחור את מערכת הבדיקה המתאימה בהתאם לתכונות המטבוליות של התרכובת, והעיקרון הוא זה שנבחר במערכת זו קצב חילוף חומרים גבוה. באופן כללי, מיקרוזומי כבד הם הבחירה הטובה ביותר כאשר המולקולות המורכבות הן יותר מים - מסיסים ואחד - מטבוליזם שלב הוא המסלול המטבולי העיקרי (במיוחד באמצעות CYP); כאשר שני - מטבוליזם שלב הוא המסלול העיקרי, ההידרוליזה היא המסלול המטבולי העיקרי, קשירת חלבון לא ספציפית במיקרוזומי הכבד גבוהה מאוד, ומטבוליזם אינו ברור במיקרוזומי הכבד, ניתן לבצע את הבדיקה באמצעות הפטוציטים ראשוניים.
ש ： האם ריכוז המיקרוזומים נבדק בבדיקת היציבות המטבולית? מה ההשפעה של גבוה מדי או נמוך מדי?
A ： בבדיקת היציבות המטבולית, ריכוז החלבון ישפיע גם על קצב חילוף החומרים, בדרך כלל בחר בריכוז החלבון המיקרוסומלי של 0.1 מ"ג/מ"ל ~ 1 מ"ג/מ"ל, הבחירה הספציפית בכמה ריכוז חלבון יש לבחור בהתאם לתכונות המטבוליות של המתחם. ריכוז גבוה מדי של חלבון מיקרוסקומלי יוביל לקשרה לא ספציפית של התרופה לחלבון המיקרוזומלי; אמנם ריכוז נמוך מדי של חלבון מיקרוסומלי עלול להוביל למטבוליזם חסר חשיבות של התרופה.