Comet талдауы үшін слайдтарды қалай дайындауға болады
ТаКометаның талдауы, сондай-ақ сингс деп аталады - Ұяшық гель электрофорезі, жеке жасушаларда ДНҚ-ның зақымдануын сандық және жан-жақты әдіс. Жоғары - сапалы дайындықComet Assay SlidideS - бұл талдау нәтижелерінің сенімділігі мен репродукциясын анықтайтын маңызды қадам. Бұл мақалада комета талдауы үшін слайдтарды дайындау, даладағы сарапшылардан түсінік беру бойынша кешенді нұсқаулық беруге бағытталған. Біз әрбір шешуші қадамды, ұяшықтарды таңдаудан бастап, деректерді түсіндіруге дейін, мүмкін, ең жақсы нәтижеге қол жеткізіңіз.Кометаның талдауы және оның маңыздылығы
● Comet талдауына шолу
1980 жылдардың аяғында жасалған Comet Assaial жеке эукариотикалық жасушаларда ДНҚ-ді үзілістерді анықтаудың қуатты құралы болып табылады. Ол генотоксикалық тестілеу, молекулалық эпидемиология және қоршаған ортаға биомониторинг сияқты өрістерде кеңінен қолданылады. Кометаның талдауы принципі агароза ішінде жасушаларды ендіруді қамтиды, оларды мембраналар мен ақуыздарды кетіру, содан кейін ДНҚ-ны электрофорезге ұшыратады. Кометаға ұқсайтын алынған алынған кескін ДНҚ-ның зақымдануын сандық есептеуге мүмкіндік береді.● ДНҚ-ның зақымдануындағы қосымшалар
Кометаның талдауы әсіресе, экологиялық токсиндер, радиация және фармацевтика салдарынан болатын ДНҚ-ның зақымдануында құнды болып табылады. Олар сонымен қатар әр түрлі жасуша түріндегі ДНҚ жөндеу механизмдерінің тиімділігін бағалауда маңызды рөл атқарады. Зерттеушілер Кометаның, қартаюдың, қартаюды және ДНҚ-ның зақымымен байланысты басқа ауруларды зерттеу үшін Commet ASSATS қолданады.● генотоксикалық тестілеудегі маңызы
Кометаның талдауларының нормативтік-зерттеу маңыздылығын төмендету мүмкін емес. Олар ықтимал генотоксикалық қосылыстарды анықтауға арналған алдын-ала скринингтік құрал ретінде қызмет етеді. Осы талдаулардың нәтижелері шешімдерге әсер етуі мүмкін - есірткіні дамыту және экологиялық қауіпсіздікті бағалау процестерін жасау.Comet талдауы үшін тиісті ұяшықтарды таңдау
● Пайдаланылған ұяшықтар түрлері
Жасушаларды таңдау кометаның талдауының нәтижесіне айтарлықтай әсер етуі мүмкін. Жиі қолданылатын ұяшықтарға лимфоциттер, буккальды жасушалар және әртүрлі мәдени ұялы сызықтар кіреді. Зерттеушілер көбінесе зерттеудің мақсаттары мен үлгілерді алудың жеңілдігіне қарай ұяшық түрлерін таңдайды.● Ұяшықтарды таңдау туралы ойлар
Ұяшықтарды таңдағанда, ұяшықтың қол жетімділігі, ДНҚ-ның зақымдануына сезімталдық және зерттеу сұрағына қатысты факторларды қарастырыңыз. Мысалы, лимфоциттер қаннан оңай алынады және генотоксикалық агенттерге сезімтал, оларды көптеген зерттеулер үшін керемет таңдау жасауға сезімтал.● талдау нәтижелеріне әсер ету
Жасушалардың шығу тегі мен күйі ДНҚ-ның зақымдануының бастапқы деңгейіне және жасушаның емдеуге реакциясына әсер етуі мүмкін. Сондықтан, дәйекті ұяшықтарды таңдау және өңдеу протоколдары кометаның болжамды талдауларында сенімді және репродуктивті нәтижелер алу үшін өте маңызды.Агароза гельдерін дайындау
● Агарозды пайдалану түрлері
Оң жақ агарозаны таңдау кометаның тұтастығы үшін өте маңызды. Төмен балқу нүктесі агарозасы артықшылықты, өйткені ол тез дамып, өңдеу кезінде ДНҚ-ны азайтады. Жоғары - Тұрақты жеткізушілерден сапа агарозасы, мысалы, сенімді кометаның слайд-жеткізушісі немесе Comet Assay Slace өндірушісі ұсынылады.● Agarose концентрациясы және дайындық қадамдары
Әдетте, 1% еріген нүктелік нүкте агарозасының концентрациясы қолданылады. Агарозаны тиісті буфермен ерітіңіз, оны толығымен ерітілгенше қыздырыңыз, содан кейін жасуша ендіруге қауіпсіз температураға дейін салқындатыңыз. Агарозаны тағамдарда артефактілерден аулақ болу үшін көпіршіктер мен қоқыстардан босатыңыз.● Оңтайлы гель сапасын қамтамасыз ету
Агароза гельының сапасы талдаудың сезімталдығы мен репродуктивтілігіне әсер етуі мүмкін. Дұрыс өңдеу және дайындау әдістері әр түрлі слайдтарда дәйекті қасиеттері бар біртекті гель шығару үшін қажет. Бұл кометалардың пайда болу мен визуализацияның біркелкі болуын қамтамасыз етеді.Агарозада жасушалық аспалы және ендіру ұяшықтары
● Ұяшық суспензиясын дайындау
Бірыңғай - ұяшықтар суспензиясын алудан бастаңыз. Мәдени жасушалар үшін бұл трипсинизацияны қамтиды, содан кейін залалсыздандыру және жуу. Лимфоциттер сияқты бастапқы жасушалар үшін қолайлы буфердегі центрифугалау және реанимация қажет. Жасушаның концентрациясын шамамен 1 x 10 ^ 5 ұяшықтар / мл көз жеткізу үшін гемокитометрді қолданыңыз.● Төмен балқытатын балшықтарды ағындарда ендіру
Ұяшық суспензиясын алдын-ала алдын-ала қолмен араластырыңыз. Қоспаны тез арада «Салқындық слайд» зауытынан немесе сенімді жеткізушіден сатып алуға болатын алдын-ала желдеткіш слайдтарға тез тамызыңыз. Агарозаны біркелкі тарату және ауа көпіршіктерінің алдын алу үшін мұқабаны қолданыңыз.● Ұяшықтарды слайдтарға тарату
Агароза таралғаннан кейін, слайдтардың салқын бетіне немесе тоңазытылған аймақта салқындатуға және қатайтуға мүмкіндік беріңіз. Бұл қадам агарозаның біршама емес, анализ кезінде кометалардың визуализациясына әсер етуі мүмкін алдын-алу үшін тиімді болуы керек.Слайдтардағы жасушалардың лизисі
● Лизиз ерітіндісі
Лизиз ерітіндісінде әдетте NACL, EDTA және Triton x (Triton x -), мысалы, жасушаларды тиімді түрде лизингке және мембраналар мен ақуыздарды алу үшін жоғары концентрациялар бар.● лизис процедуралары мен шарттары
Слайдтарды лизиз ерітіндісіне батырып, кем дегенде 1 сағат ішінде 4 ° C-қа дейін инкубациялаңыз, бірақ түнде инкубация жиі артық көреді. Булану мен ластанудың алдын алу үшін лизиздер ыдысының жабылғанына көз жеткізіңіз. Лизис сатысының шарттары ДНҚ-ды арзансыз ұялы құрылыстарды кетіру үшін өте маңызды.● Жасушаның толық лизисінің маңыздылығы
Толық емес лизис кометаның нашарлауына және сенімсіз мәліметтерге әкелуі мүмкін. Сондықтан, лизиз протоколын мұқият орындау қажет, бұл слайдтың барлық бөліктерін және инкубация уақыттарының жасуша бұзылуына жеткілікті.Сілтілі және электрофорездің шарттары
● сілтілі ерітінді дайындау
Сілтілі ерітінді, көбінесе NaOH және EDTA қоспасы ДНҚ-ны босату үшін қолданылады. Оның дайындығы дұрыс, дұрыс рН және молярлықты қамтамасыз ету керек. Оның тиімділігін сақтау үшін ерітіндіді жаңадан дайындаңыз.● сілтілі маңызды және уақыт
ДНҚ-ны босатуға мүмкіндік беру үшін әдетте 20 - 40 минут ішінде сілтілі ерітіндіде слайдтарды инкубациялаңыз. Бұл қадам жалғыздық үшін өте маңызды болып табылады - Өзіңіздің нақты протоколыңыз бен ұяшық түріңізге сүйене отырып, босату уақытын оңтайландыру.● Электрофорезді орнату және параметрлер
Суық сілтілі электрофорездің буфері бар электрофорезді ыдысты орнатыңыз. Слайдтарды резервуарларға салыңыз, олардың толығымен су астында кетеді. Тұрақты кернеуді (әдетте шамамен 25 В) қолданыңыз (әдетте шамамен 25 В), 20 минут. ДНҚ көші-қонының ең жақсы шешіміне қол жеткізу үшін электрофорездің шарттары, оның ішінде кернеу мен уақыт оңтайландырылуы керек.Бейтараптандыру және бояу процесі
● бейтараптандыру буферін дайындау және қолдану
Электрофорезден кейін реакцияны тоқтату және ДНҚ-ны тұрақтандыру үшін слайдтарды бейтараптандырыңыз. Ортақ бейтараптандыру буферінде 7.5 рН-дағы трис базасы бар. Слайдтарды сілтілі ерітіндідің барлық іздерін алып тастау үшін осы буфердегі слайдтарды бірнеше рет ақырын шайыңыз.● Даунинг техникасы
Бейтараптандырылған слайдтарды флуоресцентті ДНҚ-мен дақ қалдырыңыз - Энидиум бромиді немесе сбр жасыл сияқты байланыстырушы бояу. Этидиум бромид, классикалық, ал классикалық, мутагендік қасиеттеріне байланысты мұқият өңдеуді қажет етеді. Sybr Green жоғары сезімталдықпен қауіпсіз балама ұсынады. Қара түске боялған ерітіндідегі слайдтарды қараңғыда (әдетте 15 - 30 минут) инкубациялаңыз.● ДНҚ кометаларын визуализациялау
Доябағаннан кейін, үстіңгі дақтарды кетіру үшін слайдтарды ақырын шайыңыз. Слайдтарды флуоресценттік микроскоппен тексеріңіз. Дотаринаның сапасы мен микроскоптың ажыратымдылығы кометалардың нақты бейнелерін алу үшін өте маңызды.Микроскопия және кескінді талдау
● Дұрыс микроскопты таңдау
Тиісті сүзгі жиынтығымен жабдықталған флуоресценция микроскопы дақты ДНҚ-ға визуализациялау үшін қажет. Кометаның егжей-тегжейлі бейнелерін түсіруге қабілетті жоғары ажыратымдылығы мен камера жүйесі бар микроскопты таңдаңыз.● Жоғары - сапа кескіндері
Статистикалық маңыздылығын қамтамасыз ету үшін слайдқа кемінде 50 кометаның суреттерін түсіріңіз. Артефактілерден аулақ болу үшін тіпті жарықтандыруды және назар аударыңыз. Микроскоп пен камера параметрлерін дұрыс калибрлеу кескін сапасын едәуір жақсартады.● Кометаның талдауы үшін бағдарламалық жасақтама
Кометалар мен Касп сияқты комета талдауы үшін бірнеше бағдарламалық жасақтама қол жетімді. Бұл бағдарламалар ені, құйрықтың ұзындығы, құйрығы, құйрықты және құйрық сияқты параметрлерді өлшейді, бұл ДНҚ-ның зақымдануын талап етеді.Жалпы мәселелердің ақаулықтарын жою
● жалпы проблемалар
Комета талдауларындағы жалпы мәселелер жоғары фликересценция, кометаның төмен формациясы және слайдтар арасындағы сәйкес келмейтін нәтижелерге жатады. Бұл проблемалар әртүрлі көздерден, соның ішінде жасушалардың нашарлауы, субопиялық гельді дайындау және дұрыс емес лизис немесе электрофорез жағдайлары болуы мүмкін.● Шешімдер және алдын-алу шаралары
Жоғары флуоресценциядан азайтуға, барлық реагенттер мен гельдердің ластаушы заттардан босатылуын қамтамасыз етіңіз. Кометаның төмен түзілуіне арналған, ұяшықтың өміршеңдігі жоғары екенін тексеріп, лизис шарттары оңтайлы екенін тексеріңіз. Слайдты дәйекті дайындық және мұқият протоколды ұстану - негізгі алдын-алу шаралары.● репродуктивтілікті және дәлдікті қамтамасыз ету
Кометаның талдауларына репродукция беруге қол жеткізу қатаң протоколды стандарттауды және әр қадамды тұрақты түрде тексеруді талап етеді. Жабдықты үнемі калибрлеу, жоғары - сапа реагенттерін қолданыңыз және дәлдікті қамтамасыз ету үшін барлық тәжірибелік шарттардың толық жазбаларын сақтаңыз.Деректерді түсіндіру және есеп беру нәтижелері
● Кометаның құйрығының параметрлерін талдау
ДНҚ-ның зақымдануын сандық бағалаудың негізгі параметрлеріне құйрықтың мөлшерін және құйрықтың мөлшерін білдіретін құйрық ұзындығы, құйрық қарқындылығы, құйрық қарқындылығы жатады. Зәйтүн құйрығы, композициялық өлшеу, сонымен қатар жиі қолданылады.● Деректер туралы есептердегі статистикалық пікірлер
Дәл статистикалық талдау деректерді түсіндіру үшін қажет. Әр түрлі үлгі топтары арасындағы ДНҚ зақымдану деңгейін салыстыру үшін тиісті статистикалық тесттерді қолданыңыз. Бірнеше слайдтардан алынған мәліметтердің және эксперименттердің өзгеруіне көз жеткізіңіз.● Тапсырыстарды ұсыну және түсіндіру
Негізгі нәтижелерді суреттеу үшін графиктер мен кестелерді қолдана отырып, нақты және қысқаша түрдегі нәтижелеріңізді көрсетіңіз. ДНҚ-ның зақымдану деңгейінің салдарын талқылаңыз және зерттелетін биологиялық жүйеге ықтимал әсерін талқылаңыз.Қорытынды: Жоғары - Сапа кометасының сапа бойынша слайдтар
Дайындық - Сапа кометасының сапа бойынша слайд-слайдтар жасуша таңдауын, агароза гельді дайындауды, лизикалық шарттарды, электрофорезді, дақтандыруды және кескінді талдауды мұқият қарастыруды қамтиды. Әр қадам сенімді және репродуктивті нәтижелерді қамтамасыз ету үшін мұқият оңтайландырылған және стандартталған болуы керек. Тіркелетін кометаның талдаушыларымен бірлесіп, слайд жеткізушілері мен өндірушілері сіздің талдауыңыздың сапасын жоғары бағамен қамтамасыз ету арқылы анықтай алады.● туралыIPhaseБилік
Штаралдары Солтүстік Уэльсте, Пенсильванияда, IPhase Biocteds - «Мамандандырылған, роман және инновациялық» жоғары бағалануы, технологиялық кәсіпорын, инновациялық биологиялық реагенттердің ғылыми-зерттеу, дамуы, өнімі, сатылымы және техникалық қызметтері. Ғылыми зерттеулерге деген құштарлық пен ғылыми зерттеулерге деген құштарлық, біздің тәжірибелі мамандардың 50-ден астам тәжірибелі мамандары біздің ғылыми-зерттеу жұмыстарына әлем бойынша инновациялық биологиялық реаологиялық реаиненттерді жеткізуге және ғылыми-зерттеу жұмыстарына олардың ғылыми мақсаттарына жетуге көмектесуге дайын. «Инновациялық реагенттер, болашақты зерттейтін инновациялық реагенттер» ғылыми-зерттеушкесін жүргізу, IPhase АҚШ, Еуропа және Шығыс Азия елдеріндегі бірнеше ғылыми орталықтар, қойма орталықтары, қойма және тарату бойынша серіктестер - 12000 шаршы метрді құрады.POST уақыты: 2024 - 08 - 28 14:05:21