Q : 대사 안정성 연구를 위해 마이크로 솜과 간세포를 어떻게 선택해야합니까? 요구 사항을 충족하기 위해 그들 중 하나만 선택할 수 있습니까?
A : 대사 안정성 연구에서, 간 마이크로 솜 또는 간세포의 선택은 주로 화합물의 대사 특성에 의존하며, 여기서 높은 대사 속도를 가진 사람이 선택됩니다. 일반적으로, 간 마이크로 솜이, 특히 화합물 분자가 더 많은 물 - 가용성이고 하나의 상 대사가 주요 대사 경로 (특히 CYP를 통해) 일 때, 특히 간 마이크로 솜이 바람직하다. 간세포는 주요 경로로서 2 개의 상 대사, 주요 대사 경로로서 가수 분해, 간 마이크로 좀에서의 높은 비특이적 단백질 결합 및 간 마이크로 솜에서의 대사가 명백하지 않을 때 실험에 사용될 수있다. 일반적으로 하나의 대사 시스템이 필요에 맞게 선택할 수 있습니다. 모든 측면의 조건이 허용되면 동시에 두 시스템을 모두 선택하는 것이 가장 좋습니다.
Q : 효소 유도 분석에 1 차 간세포를 사용해야하는 이유는 무엇입니까?
A : CYP 효소 - 유도 된 분석은 활성 CYP 효소 단백질을 얻기 위해 "전사", "번역"으로부터 "단백질의 번역 변형"으로 이동해야한다. 따라서, 시험 시스템은 간 마이크로 솜나 간 S9가 아닌 간 세포 여야한다.
Q : 효소 유도 분석을 위해 3 개의 공여자 인간 1 차 간세포를 선택 해야하는 이유는 무엇입니까?
A : 약물 상호 작용에 대한 지침에 대한 소개에 따르면, 최소 3 개의 공여자를 사용해야하며, 각 공여자의 유도 결과는 별도로 평가되어야합니다. 통계적으로 유의 한 결과를 생성하는 것 외에도, 실험을위한 3 개의 공여자의 선택은 개별 변화를 평가하는 데 더 중요합니다. 하나 이상의 공여자로부터의 결과가 미리 결정된 임계 값을 초과하는 경우, 약물 후보가 유도 가능하고 다음 평가가 필요할 수 있습니다.
Q : UGT 효소 유도가 아닌 CYP 효소 유도에만 초점을 맞추는 이유는 무엇입니까?
A : CYPase 유도에 중점을 둔 이유는 CYPase 유도 메커니즘이보다 명확하게 연구 되었기 때문입니다. 다시 말해, ugtase 유도에 대한 연구를 요구하지 않는 이유는 메커니즘이 여전히 불분명하기 때문입니다. 그러나 이것이 Ugtase가 유도되지 않는다는 것을 의미하지는 않습니다. 이 지침은 또한 수송 체의 유도제 또는 억제제에 대한 표준화 된 분류 시스템과 II 상 대사 효소가 없다고 명시하고있다.
Q : 소생술 후 부착 된 1 차 간세포가 얼마나 오래 생존 할 수 있으며, 소생술 후 부착 된 배양없이 간세포를 얼마나 오래 유지할 수 있습니까?
A : 저온 살균 1 차 간세포는 일반적으로 효소 유도 분석에 사용된다. 세포 회복 후, 세포는 플레이트 확산 배지에 현탁되고, 적절한 농도로 조정되고, 콜라겐 코팅 된 플레이트에서 배양된다; 그런 다음 세포는 4 ~ 6 시간 내에 저온 살균 될 수 있습니다. 세포가 벽에 부착 된 후, 유지 보수 배지를 18 시간 동안 교체하고 유지하여 세포 상태의 최대 복원을 보장합니다. 다음으로, 효소 유도 분석은 대사 활성 및 mRNA 유도 수준을 검출하기 위해 수행 될 수있다. 전체 사이클의 관점에서, 간세포는 벽 준수 후 6 ~ 7 일 동안 유지 될 수있다. 시간이 지남에 따라 세포벽 부착 상태가 악화되고 세포가 분리되어 매달린다.
부착 성 간세포가 배양되지 않으면, 우리는 그것들이 4 ~ 6 시간 이내에 좋은 상태로 유지 될 수 있음을 확인했습니다. 우리는 아직 더 오랜 기간 동안 검증을 수행하지 않았습니다.
Q : 간세포는 사용 된 상이한 배양 배지에 따라 현탁액 및 부착 세포로 사용될 수 있습니까?
A : 고체 조직 및 기관의 대부분의 세포는 벽으로 구성되지만, 시험관 내에서 배양 할 때 모든 세포가 벽에 걸린 것은 아닙니다. 세포가 벽인지 여부 - 동시에, 벽 - 부착 성 세포는 세포 부착 과정에 참여할 수있는 특정 배양 배지 및 일부 특수한 프로 - 세포 부착 물질 (예를 들어, Rhamnogelinogen, laminin, fibronectin, 혈청 확장 인자)이 필요합니다. 결론적으로, 부착 된 세포는 현탁 세포로 사용될 수 있지만, 부착 된 사용을 위해 현탁액 세포가 반드시 이용 가능할 필요는 없다.
Q : 부착 성 벽 구절 서스펜션 간세포 사용의 장점/단점은 무엇입니까? 의사 결정 기준은 무엇입니까?
A : 간세포가 분리 된 후에는 현탁액 또는 부착 벽에서 배양 할 수 있습니다. 현탁액 배양 1 차 간세포로부터의 시토크롬 P450 효소의 활성은 처음 4 ~ 6H의 생체 내에서의 활성과 가장 일치하며, 시간 연장에 따라 빠르게 감소한다. 따라서, 현탁액 간세포는 일반적으로 대사 안정성 연구 또는 대사 산물 프로파일 링 연구에 사용된다. 부착 성벽에서 배양 된 1 차 간세포는 정상 간세포의 생물학적 특성 및 대사 활성을 유지하기 위해 손상으로부터 회복하기에 충분한 시간을 갖습니다. 따라서, 이들은 일반적으로 효소 유도 연구, 약물 세포 독성 연구, 느린 대사 약물의 대사 안정성 또는 생성물 추론 연구에 사용됩니다.
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Q ： 비 특정 단백질 결합은 테스트 결과에 어떤 영향을 미칩니 까?
A ： 약물 후보가 비 - 특별히 미세 소소 단백질에 결합하는 경우, 이로 인해 동 역학적 파라미터가 변경됩니다. 단백질 농도가 증가함에 따라, KM 값이 증가하여 낮은 고유의 클리어런스를 초래한다. 또한, 마이크로 솜에서 약물 후보의 단백질에 대한 결합은 다른 실험실과 다른 시스템의 결과에 큰 변화를 초래할 수있다.
Q ： Phase I 또는 Phase II 대사 안정성 키트의 지시 매뉴얼에서 간 마이크로 솜 단백질의 권장 농도는 0.1 mg/ml - 1 mg/ml입니다. 이것은 간 마이크로 솜을 사용할 때 시스템에 추가하기 전에 잘 희석해야한다는 것을 의미합니까?
에이: 먼저 간 마이크로 솜을 희석 할 필요가 없습니다. 키트에서 간 마이크로 솜의 농도는 20 mg/ml이고 시험 시스템에서 간 마이크로 솜의 최종 농도는 0.1 - 1 mg/mL이며, 이는 비례 적으로 첨가 될 수있다.
Q ： 1 차 간세포의 대사 안정성 시험에 권장되는 세포 밀도는 무엇입니까? 간장 계산은 간 마이크로 솜과 동일합니까?
A ： 1 차 간세포 대사 안정성 분석에 대한 권장 세포 밀도는 0.5 ~ 2 × 10입니다.6 세포/mL, 및 간 미세 소소체 대사 안정성 분석 결과의 클리어런스 계산 및 처리는 일관성이있다.
Q ： PBS 버퍼의 주요 성분은 무엇입니까? KCL과 NACL이 포함되어 있습니까?
A ： PBS 버퍼의 주요 구성 요소는 k입니다2HPO4 그리고 kh2PO4KCL과 NACL이 없습니다.
Q ： 인산 완충액의 목적은 무엇입니까? 인산염이 필요한 이유는 무엇입니까?
A ： 인산염 완충제는 생리 학적 환경을 모방하기 위해 선택되며 인산염은 신체의 유체 환경을 유지하기위한 가장 중요한 완충제 쌍 중 하나입니다.
Q ： 효소의 일반적인 설정은 무엇입니까 - 유도 된 수용체 농도는 무엇입니까? 테스트 할 시스템의 용해도가 열악한 경우 해결책이 있습니까?
A ： 효소 유도 분석은 3 가지 다른 농도로 설정되어야하며, 농도 수준은 인간의 예상 효과적인 혈액 약물 농도를 커버하기 위해 필요하며, 가장 높은 농도는 인간의 평균 유효 혈액 약물 농도보다 적어도 1 배 더 높은 것으로 선택됩니다. 수성상의 용해도가 열악한 경우, 유기 용매를 용매로 선택할 수 있습니다. DMSO, 그러나 시스템에 추가 된 유기 용매의 양은 제어해야합니다.
Q ： 대사 안정성 연구에서 시험을 위해 두 가지 시험 시스템, 간 마이크로 솜 및 1 차 간세포를 사용해야합니까?
A- 간 마이크로 솜은 균질화 및 간 조직의 균질화 및 차등 원심 분리기 동안 수득 된 단편화 된 소포체의 자체 융합에 의해 형성된 구조와 같은 거의 구형 막 소포이다. 1 차 간세포 (PHC)는 동물 간으로부터 직접 분리 직후 배양 된 간세포이며, 이는 기본적으로 간의 대사 기능을 유지하며, 특히 생체 내에서의 효소 수준을 더 잘 보존하는 더 나은 효소 수준을 유지한다. 대사 안정성 연구에서는 비용을 고려할 필요가 없으며 동시에 테스트를 위해 두 개의 테스트 시스템을 선택할 수 있습니다. 또는 적절한 시험 시스템은 화합물의 대사 특성에 따라 선택 될 수 있으며, 원리는 어느 시스템이 높은 대사 속도를 갖는 지에 대한 원칙이다. 일반적으로, 화합물 분자가 물이 더 많을 때 간 마이크로 솜이 최선의 선택이다. 두 상 대사가 주요 경로 인 경우, 가수 분해는 주요 대사 경로이고, 간 마이크로 솜에서 비 - 특이 적 단백질 결합은 매우 높고 간 마이크로 솜에서는 대사가 명백하지 않으며, 1 차 간세포를 사용하여 시험을 수행 할 수있다.
Q ： 대사 안정성 테스트에서 마이크로 솜의 농도가 검사 되었습니까? 너무 높거나 너무 낮은 효과는 무엇입니까?
A- 대사 안정성 테스트에서, 단백질 농도는 또한 대사 속도에 영향을 미치며, 일반적으로 0.1 mg/ml ~ 1 mg/ml의 마이크로 솜 단백질 농도를 선택하고, 화합물의 자체 대사 특성에 따라 얼마나 많은 단백질 농도가 선택되어야하는지의 특정 선택. 너무 높은 A 농도의 마이크로 솜 단백질은 마이크로 솜 단백질에 대한 약물의 비 특이 적 결합을 유발할 것이다; 너무 낮은 반면, 농도의 마이크로 솜 단백질은 약물의 미미한 대사를 유발할 수있다.