Kaip paruošti skaidres kometos tyrimui
Thekometos tyrimas, taip pat žinomas kaip pavienių ląstelių gelio elektroforezė, yra jautri ir universali DNR pažeidimo kiekybiškai atskirų ląstelių kiekybinis metodas. Paruošti aukštą - kokybęKometos tyrimo skaidrėS yra kritinis žingsnis, nustatantis tyrimo rezultatų patikimumą ir atkuriamumą. Šiuo straipsniu siekiama pateikti išsamų skaidrių paruošimo kometos tyrimui vadovą, integruojant šios srities ekspertų įžvalgas. Mes apžvelgsime kiekvieną esminį žingsnį, pradedant ląstelių pasirinkimu ir baigiant duomenų aiškinimu, užtikrindami, kad pasieksite geriausius įmanomus rezultatus.Įvadas į kometos tyrimą ir jo svarbą
● Kometo tyrimo apžvalga
Devintojo dešimtmečio pabaigoje sukurtas kometos tyrimas yra galingas įrankis, skirtas aptikti DNR grandinės pertraukas atskirose eukariotų ląstelėse. Jis plačiai naudojamas tokiose srityse kaip genotoksiškumo tyrimas, molekulinė epidemiologija ir aplinkos biologinis biologinis. Kometos tyrimo principas apima ląstelių įterpimą į agarozę, lizuojant jas pašalinti membranas ir baltymus, o po to DNR naudoja elektroforezę. Gautas vaizdas, primenantis kometą, leidžia kiekybiškai įvertinti DNR pažeidimą.● Taikymas DNR pažeidimo aptikime
Kometos tyrimai yra ypač vertingi nustatant DNR pažeidimus, kuriuos sukelia aplinkos toksinai, radiacija ir vaistai. Jie taip pat vaidina esminį vaidmenį vertinant DNR atstatymo mechanizmų efektyvumą įvairiuose ląstelių tipuose. Tyrėjai naudoja kometos tyrimus vėžiui, senėjimui ir kitoms ligoms, susijusioms su DNR pažeidimais, tirti.● Svarba atliekant genotoksiškumo testavimą
Negalima įvertinti kometų tyrimų reguliavimo ir tyrimų reikšmės. Jie tarnauja kaip esminė preliminarus atrankos įrankis galimiems genotoksiniams junginiams nustatyti. Šių tyrimų rezultatai gali turėti įtakos sprendimui - Narkotikų kūrimo procesų ir aplinkos saugos vertinimų procesų.Tinkamų ląstelių pasirinkimas kometos tyrimui
● Naudotų ląstelių tipai
Ląstelių pasirinkimas gali smarkiai paveikti kometos tyrimo rezultatą. Dažniausiai naudojamos ląstelės yra limfocitai, žandikaulio ląstelės ir įvairios kultūringos ląstelių linijos. Tyrėjai dažnai pasirenka ląstelių tipus, remdamiesi tyrimo tikslais ir lengvumu gauti mėginius.● Ląstelių pasirinkimo aspektai
Renkantis ląsteles, apsvarstykite tokius veiksnius kaip ląstelių prieinamumas, jautrumas DNR pažeidimui ir reikšmė tyrimo klausimui. Pavyzdžiui, limfocitai lengvai gaunami iš kraujo ir yra jautrūs genotoksiniams vaistams, todėl jie yra puikus pasirinkimas daugeliui tyrimų.● Poveikis tyrimo rezultatams
Ląstelių kilmė ir būsena gali paveikti pradinį DNR pažeidimo lygį ir ląstelės reakciją į gydymą. Todėl nuoseklūs ląstelių pasirinkimas ir tvarkymo protokolai yra labai svarbūs norint gauti patikimus ir atkuriamus rezultatus kometos tyrimuose.Agarose gelių paruošimas
● Agarozės rūšys, kurias reikia naudoti
Pasirinkti tinkamą agarozę yra gyvybiškai svarbi kometos tyrimo vientisumui. Pirmenybė teikiama žemai lydymosi taškui agarozei, nes ji greitai sukietėja ir sumažina DNR pažeidimą perdirbimo metu. Rekomenduojama aukšta patikimų tiekėjų kokybiška agarozė iš patikimų tiekėjų, tokių kaip patikimos kometos tyrimo skaidrių tiekėjo ar kometos tyrimo skaidrių gamintojo.● Agarozės koncentracijos ir paruošimo žingsniai
Paprastai naudojama 1% mažos lydymosi taško agarozės koncentracija. Agarozę ištirpinkite tinkamame buferyje, kaitinkite, kol visiškai ištirps, ir atvėsinkite iki temperatūros, kuri yra saugi ląstelėms įterpti. Įsitikinkite, kad agarozėje nėra burbuliukų ir šiukšlių, kad tyrime būtų išvengta artefaktų.● Užtikrinti optimalią gelio kokybę
Agarozės gelio kokybė gali paveikti tyrimo jautrumą ir atkuriamumą. Tinkami tvarkymo ir paruošimo būdai yra būtini norint sukurti vienalytį gelį, turintį nuoseklias savybes skirtingose skaidrėse. Tai užtikrina, kad kometų formavimasis ir vizualizacija yra vienodi.Ląstelių suspensija ir ląstelės į agarozę
● Ląstelių pakabos paruošimas
Pradėkite gauti vieną - ląstelės suspensiją. Kultūrinėms ląstelėms tai apima tripsinizaciją, po to neutralizuoti ir plauti. Pirminėms ląstelėms, tokioms kaip limfocitai, būtina centrifugavimas ir resuspensija tinkamame buferyje. Naudokite hemocitometrą, kad užtikrintumėte maždaug 1 x 10^5 ląstelių/ml ląstelės koncentraciją.● Ląstelių įdėjimas į mažo lydymosi taško agarozę
Sumaišykite ląstelės suspensiją su prieš - sušildytu žemo lydymosi taško agaroze santykiu, kuris užtikrina vienodą ląstelių pasiskirstymą. Greitai pipetę mišinį ant iš anksto padengtų kometos tyrimo skaidrių, kurias galima įsigyti iš kometos tyrimo skaidrių gamyklos arba patikimo tiekėjo. Norėdami tolygiai paskleisti agarozę ir išvengti oro burbuliukų, naudokite dangtį.● Ląstelių paskirstymas ant skaidrių
Kai agarozė bus paskirstyta, leiskite skaidrėms atvėsti ir sukietėti šaltame paviršiuje ar šaldytuve. Šis žingsnis turi būti atliktas efektyviai, kad agarozė negalėtų nustatyti netolygiai, o tai gali paveikti kometų vizualizaciją analizės metu.Ląstelių lizė ant skaidrių
● lizės tirpalo sudėtis
Lizės tirpale paprastai yra didelė druskos ir ploviklių koncentracija, pavyzdžiui, NaCl, EDTA ir Triton X - 100, kad būtų galima efektyviai susilieti ląsteles ir pašalinti membranas bei baltymus, paliekant DNR nepažeistą.● Lizės procedūra ir sąlygos
Panaikinkite lizės tirpalo skaidres ir inkubuokite 4 ° C temperatūroje mažiausiai 1 valandą, nors dažnai teikiama pirmenybė inkubuojant per naktį. Įsitikinkite, kad lizės bakas yra padengtas, kad išvengtumėte išgarinimo ir užteršimo. Lizės žingsnio sąlygos yra labai svarbios norint pašalinti ląstelių sudedamąsias dalis, nesumažėjus DNR.● Visiškos ląstelių lizės svarba
Nepilnas lizės gali atsirasti blogas kometos susidarymas ir nepatikimi duomenys. Todėl būtina kruopščiai laikytis lizės protokolo, užtikrinančio, kad tirpalas prasiskverbtų į visas skaidrės dalis ir to, kad inkubacijos laikų pakanka visiškam ląstelių sutrikimui.Šarminiai atsipalaidavimo ir elektroforezės sąlygos
● Šarminio tirpalo paruošimas
Šarminis tirpalas, dažnai NAOH ir EDTA mišinys, naudojamas DNR atsipalaidavimui. Jo paruošimas turėtų būti atliekamas atsargiai, užtikrinant teisingą pH ir molariumą. Šviežiai paruoškite sprendimą, kad išlaikytumėte jo veiksmingumą.● Šarminis atsipalaidavimas ir laikas
Inkubuokite skaidres šarminio tirpale, paprastai 20 - - 40 minučių, kad DNR sruogos galėtų atsipalaiduoti. Šis žingsnis yra labai svarbus norint aptikti pavienes - sruogų pertraukėles ir šarminius - labilus vietas. Optimizuokite atsipalaidavimo laiką, atsižvelgiant į jūsų specifinį protokolą ir ląstelės tipą.● Elektroforezės sąranka ir parametrai
Nustatykite elektroforezės baką su šaltu šarminio elektroforezės buferiu. Įdėkite skaidres į rezervuarą, užtikrindami, kad jos būtų visiškai panardintos. Užtepkite pastovią įtampą (paprastai apie 25 V) 20 - 30 minučių. Norint pasiekti geriausią DNR migracijos skiriamąją gebą, turi būti optimizuotos elektroforezės sąlygos, įskaitant įtampą ir laiką.Neutralizavimas ir dažymo procesas
● Neutralizacijos buferio paruošimas ir naudojimas
Po elektroforezės neutralizuokite skaidres, kad sustabdytumėte reakciją ir stabilizuotumėte DNR. Įprastame neutralizavimo buferyje yra TRIS bazė, kurios pH yra 7,5. Kelis kartus švelniai nuplaukite šiame buferio skaidrėse, kad pašalintumėte visus šarminio tirpalo pėdsakus.● Dažymo būdai
Nuspauskite neutralizuotus skaidres fluorescencine DNR - surišančiais dažais, tokiais kaip etidžio bromidas arba SYBR žalias. Etidžio bromidui, nors ir klasikui, reikia kruopščiai tvarkyti dėl jo mutageninių savybių. „Syber Green“ siūlo saugesnę alternatyvą, turinčią didelį jautrumą. Inkubuokite dažymo tirpalo skaidres tinkamu laiku (paprastai 15 - 30 minučių) tamsoje.● DNR kometų vizualizacija
Po dažymo švelniai nuplaukite skaidres, kad būtų pašalintas dėmė. Išnagrinėkite skaidres pagal fluorescencinį mikroskopą. Dažymo kokybė ir mikroskopo skiriamoji geba yra labai svarbi norint gauti aiškius kometų vaizdus.Mikroskopija ir vaizdo analizė
● Tinkamo mikroskopo pasirinkimas
Norint vizualizuoti dažytą DNR, yra būtinas fluorescencinis mikroskopas su tinkamu filtro rinkiniu. Pasirinkite mikroskopą su didele skiriamąja geba ir fotoaparatų sistema, galinti užfiksuoti išsamius kometų vaizdus.● Aukšto - kokybės vaizdų fiksavimas
Užfiksuokite mažiausiai 50 kometų vaizdus kiekvienoje skaidrėje, kad būtų užtikrinta statistinė reikšmingumas. Užtikrinkite net apšvietimą ir sutelkite dėmesį, kad išvengtumėte artefaktų. Tinkamas mikroskopo ir fotoaparato nustatymų kalibravimas gali žymiai padidinti vaizdo kokybę.● Programinė įranga kometos analizei
Kometų analizei yra keletas programinės įrangos programų, tokių kaip „Cometscore“ ir „Casp“. Šios programos matuoja tokius parametrus kaip uodegos ilgis, uodegos intensyvumas ir uodegos momentas, kurie yra labai svarbūs norint kiekybiškai įvertinti DNR pažeidimą.Bendrosios problemos trikčių šalinimas
● Bendros problemos
Įprastos kometos tyrimų problemos apima aukštą fono fluorescenciją, mažai kometos susidarymą ir nenuoseklius skaidrių rezultatus. Šios problemos gali kilti iš įvairių šaltinių, įskaitant prastą ląstelių valdymą, neoptimalų gelio paruošimą ir neteisingas lizės ar elektroforezės sąlygas.● Sprendimai ir prevencinės priemonės
Norėdami sušvelninti aukštą fono fluorescenciją, įsitikinkite, kad visi reagentai ir geliai neturi teršalų. Jei norite susidaryti mažai kometos, patikrinkite, ar ląstelių gyvybingumas yra didelis, o lizės sąlygos yra optimalios. Nuoseklus skaidrių paruošimas ir kruopštus protokolo laikymasis yra pagrindinės prevencinės priemonės.● Atkuriamumo ir tikslumo užtikrinimas
Norint pasiekti atkuriamumą atliekant kometos tyrimus, reikia griežto protokolo standartizacijos ir reguliaraus kiekvieno žingsnio patvirtinimo. Reguliariai kalibruokite įrangą, naudokite aukštus kokybiškus reagentus ir palaikykite išsamius visų eksperimentinių sąlygų įrašus, kad užtikrintumėte tikslumą.Duomenų aiškinimas ir ataskaitų teikimo rezultatai
● Kominės uodegos parametrų analizė
Pagrindiniai DNR pažeidimų kiekybinio įvertinimo parametrai yra uodegos ilgis, kuris atspindi DNR migracijos mastą ir uodegos intensyvumą, kuris žymi DNR kiekį uodegoje. Taip pat dažniausiai naudojamas alyvuogių uodegos momentas, sudėtinis matavimas.● Statistiniai aspektai pateikiant duomenų pateikimą
Tiksli statistinė analizė yra būtina duomenų aiškinimui. Norėdami palyginti DNR pažeidimo lygį tarp skirtingų mėginių grupių, naudokite tinkamus statistinius testus. Įsitikinkite, kad sujungiami kelių skaidrių ir eksperimentų duomenys, kad būtų atsižvelgiama į kintamumą.● Išvadų pateikimas ir aiškinimas
Pateikite savo rezultatus aiškiai ir glaustai, naudodami grafikus ir lenteles, kad parodytumėte pagrindines išvadas. Aptarkite stebimų DNR pažeidimų lygio ir galimo poveikio tiriamą biologinę sistemą padarinius.Išvada: Aukštos kokybės kometos tyrimo skaidrių pasiekimas
Aukštos - kokybės kometos tyrimo skaidrių paruošimas apima kruopščią ląstelių atrankos, agarozės gelio paruošimo, lizės sąlygų, elektroforezės, dažymo ir vaizdo analizės svarstymą. Kiekvienas žingsnis turi būti kruopščiai optimizuotas ir standartizuotas, kad būtų užtikrinti patikimi ir atkuriami rezultatai. Bendradarbiavimas su gerbiamais kometos tyrimo skaidrių tiekėjais ir gamintojais gali pagerinti jūsų tyrimo kokybę teikdami aukštą - laipsnio medžiagą ir techninę pagalbą.● Apie„IPhase“Biosciences
Šiaurės Velse, Pensilvanijoje, „iPhase Biosciences“ būstinė yra „specializuotos, naujos ir novatoriškos“ aukštos - „Tech Enterprise“ integruotų tyrimų, plėtros, gamybos, pardavimų ir techninių paslaugų inovatyvių biologinių reagentų integravimo. Pasinaudoję didelėmis žiniomis ir aistra moksliniams tyrimams, mūsų daugiau nei 50 patyrusių ekspertų mokslinė komanda yra įsipareigojusi tiekti kokybiškus novatoriškus biologinius reagentus visame pasaulyje ir padeda tyrėjams visose jų moksliniuose pastangose padėti pasiekti jų tyrimų tikslus. Siekdamas „novatoriškų reagentų“ mokslinių tyrimų ir plėtros idealo, tyrinėjant ateitį “,„ iPhase “įsteigė daugybę MTTP įrenginių, pardavimo centrų, sandėlių ir platinimo partnerių JAV, Europoje ir Rytų Azijos šalyse, apimančiuose daugiau nei 12 000 kvadratinių metrų.Skelbimo laikas: 2024 - 08 - 28 14:05:21