J: Kā man vajadzētu izvēlēties mikrosomas un hepatocītus metabolisma stabilitātes pētījumiem? Vai es varu izvēlēties tikai vienu no viņiem, lai izpildītu prasību?
A: Metabolisma stabilitātes pētījumā aknu mikrosomu vai hepatocītu izvēle galvenokārt ir atkarīga no savienojumu metaboliskās īpašībām, kur tiek izvēlēta tā, kurai ir augsts metabolisma ātrums. Parasti priekšroka tiek dota aknu mikrosomām, it īpaši, ja savienojuma molekulas ir vairāk ūdens - šķīst un viena - fāzes metabolisms ir galvenais metabolisma ceļš (īpaši caur CYP). Hepatocītus var izmantot eksperimentiem, ja ir pierādījumi par diviem - fāzes metabolismu kā galveno ceļu, hidrolīzi kā galveno metabolisko ceļu, augstu nespecifisko olbaltumvielu saistīšanos aknu mikrosomās un metabolisms aknu mikrosomās nav paveicis. Parasti vienu metabolisma sistēmu var izvēlēties, lai apmierinātu vajadzības; Ja nosacījumi visos aspektos atļauj, noteikti vislabāk ir vienlaikus izvēlēties abas sistēmas.
J: Kāpēc ir nepieciešams izmantot primāros hepatocītus enzīmu indukcijas testam?
A: CYP enzīms - Izraisītajam testam jāiet no "transkripcijas", "tulkošanas" uz "Post - Olbaltumvielu translācijas modifikāciju", lai iegūtu aktīvu CYP enzīmu proteīnu. Tāpēc testa sistēmai jābūt aknu šūnām, nevis aknu mikrosomām vai aknām S9.
J: Kāpēc man ir jāizvēlas trīs fermentu indukcijas testa donoru cilvēka primārie hepatocīti?
A: Saskaņā ar ievadu narkotiku mijiedarbības vadlīnijās jāizmanto vismaz trīs donori, un katra donora indukcijas rezultāts jānovērtē atsevišķi. Papildus statistiski nozīmīgu rezultātu iegūšanai trīs donoru izvēle eksperimentam ir arī svarīgāka, lai novērtētu starpposma variācijas. Ja vismaz viena donora rezultāts pārsniedz iepriekš noteiktu slieksni, narkotiku kandidāts var būt inducējams un jāveic - UP novērtēšana.
J: Kāpēc koncentrēties tikai uz CYP enzīmu indukciju, nevis uz UGT enzīmu indukciju?
A: Iemesls, kāpēc koncentrēties uz Cypase indukciju, ir tas, ka Cypase indukcijas mehānisms ir pētīts skaidrāk. Citiem vārdiem sakot, iemesls, kāpēc nav nepieciešams pētīt ugtāzes indukciju, ir tas, ka mehānisms joprojām nav skaidrs; Tomēr tas nenozīmē, ka uglatase netiks ierosināta. Vadlīnijās arī teikts, ka nav standartizētu klasifikācijas sistēmas pārvadātāju induktoriem vai inhibitoriem un II fāzes metabolisma enzīmiem.
J: Cik ilgi primārie hepatocīti var izdzīvot pēc reanimācijas, un cik ilgi hepatocīti var tikt uzturēti bez pielipušas kultūras pēc reanimācijas?
A: Pasterizētus primāros hepatocītus parasti izmanto enzīmu indukcijas testiem. Pēc šūnu reģenerācijas šūnas tiek suspendētas plāksnes izplatīšanās barotnē, pielāgotas atbilstošai koncentrācijai un kultivētas kolagēnā - Pārklātas plāksnēs; Tad šūnas var pasterizēt 4 ~ 6 stundu laikā. Pēc tam, kad šūnas ir piestiprinātas pie sienas, uzturēšanas vidi aizstāj un uztur 18 stundas, lai nodrošinātu maksimālu šūnu stāvokļa atjaunošanu. Tālāk var veikt fermentu indukcijas testu, lai noteiktu metabolisma aktivitāti un mRNS indukcijas līmeni. No visa cikla viedokļa hepatocītus var uzturēt 6 ~ 7 dienas pēc sienas ievērošanas. Laikam ejot, šūnu sienas ievērošanas stāvoklis pasliktinās, un šūnas atdalīsies un apturēs.
Ja pielipušie hepatocīti netiek kultivēti, mēs esam pārliecinājušies, ka tos var uzturēt labā stāvoklī 4 ~ 6 stundu laikā. Mēs vēl neesam veikuši verifikāciju ilgāku laiku.
J: Hepatocītus var izmantot gan kā suspensijas, gan pielipušās šūnas atkarībā no dažādām izmantotajām barotnēm?
A: Lielākā daļa šūnu no cietajiem audiem un orgāniem ir sienas, bet ne visas šūnas ir sienas, kultivētas vitro. Tas, vai šūnas ir sienas - pielipušas vai nē, ir atkarīgas no pašu šūnu stāvokļa; Tajā pašā laikā sienai - pielipušām šūnām ir vajadzīga specifiska barotne un dažas īpašas pro - šūnu adhēzijas vielas (piemēram, ramnogelinogēnu, laminīnu, fibronektīnu, seruma izplešanās koeficientu), kas var piedalīties šūnu piestiprināšanas procesā. Noslēgumā jāsaka, ka pielipušās šūnas var izmantot kā suspensijas šūnas, bet suspensijas šūnas nav obligāti pieejamas pielipušai lietošanai.
J: Kādas ir pielipušo sienas pantus suspensijas hepatocītu izmantošanas priekšrocības/trūkumi? Kādi ir lēmuma kritēriji?
A: Pēc tam, kad hepatocīti ir izolēti, tos var kultivēt suspensijā vai pielipušā sienā. Citohroma P450 enzīma aktivitāte no suspensijas kultivētajiem primārajiem hepatocītiem ir visvairāk atbilstoši - vivo pirmajām 4 ~ 6 stundām, pēc tam strauji samazinās, pagarinot laiku. Tāpēc suspensijas hepatocītus parasti izmanto metabolisma stabilitātes pētījumā vai metabolītu profilēšanas pētījumā. Primārajiem hepatocītiem, kas kultivēti pielipušajā sienā, ir pietiekami daudz laika, lai atgūtu no bojājumiem, lai saglabātu normālu hepatocītu bioloģiskās īpašības un metabolisko aktivitāti. Tādējādi tos parasti izmanto enzīmu indukcijas pētījumos, zāļu citotoksicitātes pētījumos, lēnas metabolizējošu zāļu metabolisma stabilitātē vai produktu secinājumu pētījumos.
Pašlaik mēs nesniedzam tīmekļa lapu tiešsaistes pirkuma pakalpojumu. Produkti, kas pievienoti iepirkumu grozam pēc reģistrācijas un pieteikšanās, ir tikai atsaucei. Ja jums ir jāpērk mūsu produkti, lūdzu, atstājiet savu kontaktinformāciju, izmantojot kanālu Contact Us, un mēs savlaicīgi sazināsimies ar jums, lai pabeigtu mūsu pakalpojumus.
Q ： Kā ne - specifiska olbaltumvielu saistīšanās ietekmē testa rezultātus?
A ： Ja narkotiku kandidāts saista ne - īpaši ar mikrosomāliem proteīniem, tas rezultātā tiek mainīti kinētiskie parametri. Palielinoties olbaltumvielu koncentrācijai, KM vērtība palielinās, kā rezultātā rodas zems domājams iekšējais klīrenss. Arī zāļu kandidāta saistīšana ar olbaltumvielām mikrosomās var izraisīt lielas atšķirības dažādu laboratoriju un dažādu sistēmu rezultātos.
Q ： Ieteicamā aknu mikrosomālā olbaltumvielu koncentrācija I vai II fāzes metaboliskās stabilitātes komplekta instrukcijas rokasgrāmatā ir 0,1 mg/ml - 1 mg/ml, vai tas nozīmē, ka, lietojot aknu mikrosomas, joprojām ir nepieciešams tos labi atšķaidīt pirms sistēmas pievienošanas?
A: Vispirms nav nepieciešams atšķaidīt aknu mikrosomas; Aknu mikrosomu koncentrācija komplektā ir 20 mg/ml, un aknu mikrosomu galīgā koncentrācija testa sistēmā ir 0,1 - 1 mg/ml, ko var pievienot proporcionāli.
Q ： Kāds ir ieteicamais šūnu blīvums primāro hepatocītu metabolisma stabilitātes pārbaudei? Vai klīrensa aprēķins ir tāds pats kā aknu mikrosomām?
A ： Ieteicamais šūnu blīvums primārajam hepatocītu metabolisma stabilitātes testam ir no 0,5 līdz 2 × 106 Šūnas/ml, kā arī klīrensa aprēķini un aknu mikrosomu metaboliskās stabilitātes testa rezultātu apstrāde ir konsekventa.
Q ： Kādas ir galvenās sastāvdaļas jūsu PBS buferšķīdumā? Vai tajā ir KCL un NaCl?
A ： Mūsu PBS bufera galvenās sastāvdaļas ir K2HPO4 un KH2PO4, bez KCL un NaCl.
Q ： Kāds ir fosfātu buferu mērķis? Kāpēc jums ir nepieciešams fosfāts?
Fosfātu buferšķīdumi tiek izvēlēti to, lai atdarinātu fizioloģisko vidi, un fosfāts ir viens no vissvarīgākajiem bufer pāriem ķermeņa šķidruma vides uzturēšanai.
Q ： Kāds ir parastais fermenta iestatījums - izraisītā receptoru koncentrācija? Vai ir kāds risinājums, ja pārbaudāmās sistēmas šķīdība ir slikta?
A ： Fermentu indukcijas tests ir jāizveido ar 3 dažādām koncentrācijām, koncentrācijas līmenim ir jāaptver paredzamā efektīvā zāļu koncentrācija asinīs cilvēkiem, un augstākā koncentrācija ir izvēlēta vismaz par vienu pakāpi augstāku nekā vidējā efektīvā zāļu koncentrācija cilvēkiem. Ja šķīdība ūdens fāzē ir slikta, par tā šķīdinātāju var izvēlēties organisko šķīdinātāju, piem. DMSO, bet sistēmai pievienotā organiskā šķīdinātāja daudzums ir jākontrolē.
Q ： Vai metabolisma stabilitātes pētījumos ir nepieciešams izmantot divas testa sistēmas, aknu mikrosomas un primāros hepatocītus?
A ： Aknu mikrosomas ir gandrīz sfēriskas membrānas pūslīša - Tāpat kā struktūras, kas veidojas ar sadrumstalota endoplazmatiskā retikuluma saplūšana, kas iegūta aknu audu homogenizācijas laikā, un diferenciāli centrifugējot aknu audu, un satur CYP450 fermentus un dažus divfāzu enzīmus, piemēram, UGTS, st. Primārie hepatocīti (PHC) ir hepatocīti, kas kultivēti tūlīt pēc tiešas izolācijas no dzīvnieku aknām, kas galvenokārt uztur aknu metabolisma funkcijas, īpaši labāk saglabājot enzīmu līmeni, kas atbilst tiem, kas ir in vivo. Metabolisma stabilitātes pētījumā nav jāņem vērā izmaksas, un testam var izvēlēties vienlaikus divas testa sistēmas; Vai arī atbilstošo testa sistēmu var izvēlēties atbilstoši savienojuma metaboliskajām īpašībām, un princips ir tāds, ka sistēmai ir izvēlēts augsts metabolisma ātrums. Parasti aknu mikrosomas ir labākā izvēle, ja savienojuma molekulas ir vairāk ūdens - šķīst un viena - fāzes metabolisms ir galvenais metabolisma ceļš (īpaši caur CYP); Kad galvenais ceļš - fāzes metabolisms ir galvenais ceļš, hidrolīze ir galvenais metabolisma ceļš, ne - specifiska olbaltumvielu saistīšanās aknu mikrosomās ir ļoti augsta, un metabolisms aknu mikrosomās nav acīmredzams, testu var veikt, izmantojot primāros hepatocītus.
Q ： Vai metabolisma stabilitātes testā pārbaudīto mikrosomu koncentrācija? Kāda ir pārāk augsta vai pārāk zema ietekme?
A ： Metabolisma stabilitātes testā olbaltumvielu koncentrācija ietekmēs arī metabolisma ātrumu, parasti izvēlas mikrosomu olbaltumvielu koncentrāciju 0,1 mg/ml ~ 1 mg/ml, specifiskā izvēle par to, cik daudz olbaltumvielu koncentrācijas jāizvēlas atbilstoši paša savienojuma metaboliskajām īpašībām. Pārāk augsta mikrosomālā olbaltumvielu koncentrācija izraisīs zāļu specifisku saistīšanos ar mikrosomālo olbaltumvielu; Kaut arī pārāk zema mikrosomālā olbaltumvielu koncentrācija var izraisīt nenozīmīgu zāļu metabolismu.