M: Kif għandi nagħżel mikrosomi u epatokiti għal studji ta 'stabbiltà metabolika? Nista 'nagħżel wieħed minnhom biss biex jissodisfa r-rekwiżit?
A: Fi studju ta 'stabbiltà metabolika, l-għażla ta' mikrosomi tal-fwied jew epatokiti tiddependi prinċipalment fuq il-proprjetajiet metaboliċi tal-komposti, fejn hija magħżula dik b'rata metabolika għolja. B'mod ġenerali, il-mikrosomi tal-fwied huma preferuti, speċjalment meta l-molekuli komposti huma aktar ilma - solubbli u wieħed - Il-metaboliżmu tal-fażi huwa l-passaġġ metaboliku ewlieni (speċjalment permezz tas-CYP). L-epatokiti jistgħu jintużaw għall-esperimenti meta jkun hemm evidenza ta 'żewġ metaboliżmu tal-fażi bħala l-mogħdija ewlenija, idroliżi bħala l-passaġġ metaboliku ewlieni, proteina mhux speċifika għolja li torbot fil-mikrosomi tal-fwied, u l-metaboliżmu fil-mikrosomi tal-fwied mhuwiex evidenti. Normalment, sistema metabolika waħda tista 'tintgħażel biex tissodisfa l-bżonnijiet; Jekk il-kundizzjonijiet fl-aspetti kollha jippermettu, huwa definittivament l-aħjar li tagħżel iż-żewġ sistemi fl-istess ħin.
M: Għaliex huwa meħtieġ li tuża epatokiti primarji għall-analiżi tal-induzzjoni tal-enzimi?
A: Enzyme CYP - Test indott jeħtieġ li jmur minn "traskrizzjoni", "traduzzjoni" għal "post - modifika ta 'traduzzjoni tal-proteina" biex tinkiseb proteina attiva ta' enzima CYP. Għalhekk, is-sistema tat-test għandha tkun ċelloli tal-fwied, mhux mikrosomi tal-fwied jew fwied S9.
M: Għaliex għandi bżonn nagħżel tliet epatokiti primarji tal-bniedem donaturi għall-assaġġ ta 'induzzjoni ta' l-enzimi?
A: Skond l-introduzzjoni għal-linji gwida għall-interazzjonijiet tad-droga, għandhom jintużaw mill-inqas tliet donaturi, u r-riżultat ta 'induzzjoni ta' kull donatur għandu jiġi evalwat separatament. Minbarra l-produzzjoni ta 'riżultati statistikament sinifikanti, l-għażla ta' tliet donaturi għall-esperiment hija wkoll iktar importanti għall-valutazzjoni tal-varjazzjoni inter-individwu. Jekk ir-riżultat minn mill-inqas donatur wieħed jaqbeż il-limitu predeterminat, il-kandidat tad-droga jista 'jkun induttibbli u hija meħtieġa - evalwazzjoni ta' segwitu.
M: Għaliex tiffoka biss fuq l-induzzjoni tal-enzima CYP u mhux fuq l-induzzjoni tal-enzima UGT?
A: Ir-raġuni biex tiffoka fuq l-induzzjoni ta 'Cypase hija li l-mekkaniżmu ta' induzzjoni ta 'Cypase ġie studjat b'mod aktar ċar. Fi kliem ieħor, ir-raġuni biex ma tkunx teħtieġ l-istudju ta 'l-induzzjoni ta' UGTAse hija li l-mekkaniżmu għadu mhux ċar; Madankollu, dan ma jfissirx li l-ugtase mhux se tiġi indotta. Il-linji gwida jiddikjaraw ukoll li m'hemm l-ebda sistema ta 'klassifikazzjoni standardizzata għal indutturi jew inibituri ta' trasportaturi u enżimi tal-metaboliżmu ta 'fażi II.
M: Kemm jista 'jdum l-epatokiti primarji aderenti wara r-risuxxitazzjoni, u kemm jistgħu jżommu l-epatokiti mingħajr kultura aderenti wara r-risuxxitazzjoni?
A: Epatokiti primarji pasturizzati ġeneralment jintużaw għal testijiet ta 'induzzjoni ta' l-enzimi. Wara l-irkupru taċ-ċelloli, iċ-ċelloli huma sospiżi fil-medju tat-tixrid tal-pjanċa, aġġustati għal konċentrazzjoni xierqa, u kkultivati fil-pjanċi tal-kollaġen; Imbagħad iċ-ċelloli jistgħu jiġu pasturizzati fi żmien 4 ~ 6 sigħat. Wara li ċ-ċelloli jkunu mwaħħlin mal-ħajt, il-mezz ta ’manutenzjoni jinbidel u jinżamm għal 18 siegħa biex jiżgura r-restawr massimu tal-istat taċ-ċellula. Sussegwentement, test ta 'induzzjoni ta' l-enzimi jista 'jitwettaq biex tiskopri attività metabolika u livell ta' induzzjoni ta 'mRNA. Mill-perspettiva taċ-ċiklu kollu, l-epatokiti jistgħu jinżammu għal 6 ~ 7 ijiem wara l-aderenza tal-ħajt. Hekk kif jgħaddi ż-żmien, l-istat tal-aderenza tal-ħajt taċ-ċellula jiddeterjora, u ċ-ċelloli jinqatgħu u jissospendu.
Jekk l-epatokiti aderenti ma jiġux ikkultivati, aħna vverifikajna li jistgħu jinżammu fi stat tajjeb fi żmien 4 ~ 6 sigħat. Għadna ma wettqux verifika għal perjodu itwal.
M: L-epatokiti jistgħu jintużaw kemm bħala sospensjoni kif ukoll ċelloli aderenti skont il-midja tal-kultura differenti użata?
A: Il-biċċa l-kbira taċ-ċelloli minn tessuti solidi u organi huma b'ħitan, iżda mhux iċ-ċelloli kollha huma b'ħitan meta kkultivati f '- vitro. Jekk iċ-ċelloli huma ħajt - aderenti jew le jiddependi mill-istat taċ-ċelloli nfushom; Fl-istess ħin, il-ħajt - ċelloli aderenti għandhom bżonn ta 'medju ta' kultura speċifiku u xi sustanzi speċjali ta 'adeżjoni taċ-ċelloli (per eżempju, rhamnogelinogen, laminin, fibronectin, fattur ta' espansjoni fis-serum) li jistgħu jipparteċipaw fil-proċess ta 'twaħħil taċ-ċelluli. Bħala konklużjoni, ċelloli aderenti jistgħu jintużaw bħala ċelloli ta 'sospensjoni, iżda ċ-ċelloli tas-sospensjoni mhumiex neċessarjament disponibbli għal użu aderenti.
M: X'inhuma l-vantaġġi / l-iżvantaġġi ta 'l-użu ta' versi aderenti ta 'sospensjoni ta' hepatocytes? X'inhuma l-kriterji tad-deċiżjoni?
A: Wara li l-epatokiti jkunu iżolati, jistgħu jiġu kkultivati f'sospensjoni jew f'ħajt aderenti. L-attività ta 'l-enzima taċ-ċitokromu P450 minn sospensjoni kkultivata epatokiti hija l-iktar konsistenti ma' dik ta 'in - vivo għall-ewwel 4 ~ 6h, imbagħad tonqos malajr bit-titwil taż-żmien. Għalhekk, l-epatokiti ta 'sospensjoni huma ġeneralment użati għal studju ta' stabbiltà metabolika jew studju ta 'profil tal-metaboliti. Epatokiti primarji kkultivati fil-ħajt aderenti għandhom ħin biżżejjed biex jirkupraw mill-ħsara biex iżommu l-karatteristiċi bijoloġiċi u l-attività metabolika ta 'epatokiti normali. Għalhekk, ġeneralment jintużaw għal studji ta 'induzzjoni ta' l-enzimi, studji ta 'ċitotossiċità ta' mediċini, stabbiltà metabolika ta 'mediċini li jimmetabolizzaw bil-mod jew studji ta' inferenza tal-prodott.
Bħalissa, ma nipprovdux servizz ta 'xiri onlajn tal-webpage. Il-prodotti miżjuda mal-karrettun tax-xiri wara r-reġistrazzjoni u l-login huma għal referenza biss. Jekk għandek bżonn tixtri l-prodotti tagħna, jekk jogħġbok ħalli l-informazzjoni ta 'kuntatt tiegħek permezz tal-kanal ta' kuntatt magħna, u aħna nikkuntattjawk fil-ħin biex inlestu s-servizzi tagħna.
Q ： Kif taffettwa r-riżultati tat-test tal-proteina non - speċifika?
A ： Jekk il-kandidat tal-mediċina jgħaqqad mhux speċifikament ma 'proteini mikrosomali, dan jirriżulta f'parametri kinetiċi mibdula. Hekk kif tiżdied il-konċentrazzjoni tal-proteina, il-valur KM jiżdied, li jirriżulta fi tneħħija intrinsika preżunta baxxa. Ukoll, it-twaħħil tal-kandidat tal-mediċina mal-proteini fil-mikrosomi jista 'jirriżulta f'varjazzjonijiet kbar fir-riżultati minn laboratorji differenti u sistemi differenti.
Q ： Il-konċentrazzjoni rrakkomandata ta 'proteina mikrosomali tal-fwied fil-manwal ta' l-istruzzjoni ta 'kit ta' stabbiltà metabolika ta 'fażi I jew fażi II hija 0.1 mg / ml - 1 mg / ml, dan ifisser li meta tuża mikrosomi tal-fwied, xorta huwa meħtieġ li jitnaqqsuhom sew qabel ma jżiduhom mas-sistema?
A: M'hemmx bżonn li jitnaqqsu l-mikrosomi tal-fwied l-ewwel; Il-konċentrazzjoni ta 'mikrosomi tal-fwied fil-kit hija ta' 20 mg / ml u l-konċentrazzjoni finali ta 'mikrosomi tal-fwied fis-sistema tat-test hija 0.1 - 1 mg / mL, li tista' tiżdied proporzjonalment.
Q ： X'inhi d-densità rakkomandata taċ-ċellula għall-ittestjar tal-istabbiltà metabolika ta 'epatokiti primarji? Il-kalkolu tat-tneħħija huwa l-istess bħal għal mikrosomi tal-fwied?
A ： Id-densità taċ-ċellula rrakkomandata għall-analiżi tal-istabbiltà metabolika primarja tal-epatokiti hija 0.5 sa 2 × 106 ċelloli / ml, u l-kalkoli tal-approvazzjoni u l-ipproċessar tar-riżultati tal-assaġġ tal-istabbiltà metabolika mikrosomali tal-fwied huma konsistenti.
Q ： X'inhuma l-ingredjenti ewlenin fil-buffer PBS tiegħek? Fih KCL u NaCl?
A ： Il-komponenti ewlenin tal-buffer PBS tagħna huma k2HPO4 u kh2PO4, u huma ħielsa minn KCL u NaCl.
Q ： X'inhu l-iskop tal-buffers tal-fosfat? Għaliex għandek bżonn fosfat?
Buffers tal-fosfat huma magħżula għall-iskop tagħhom li jimitaw l-ambjent fiżjoloġiku, u l-fosfat huwa wieħed mill-aktar pari buffer importanti għaż-żamma tal-ambjent fluwidu tal-ġisem.
Q ： X'inhu l-issettjar tas-soltu għall-konċentrazzjoni tar-riċettur indotta mill-enzima? Hemm xi soluzzjoni jekk is-solubilità tas-sistema li għandha tiġi ttestjata hija fqira?
A ： L-analiżi tal-induzzjoni tal-enzima teħtieġ li titwaqqaf bi 3 konċentrazzjonijiet differenti, il-livell ta 'konċentrazzjoni jeħtieġ li jkopri l-konċentrazzjoni effettiva mistennija tad-demm fil-bnedmin, u l-ogħla konċentrazzjoni hija magħżula li tkun mill-inqas ordni ta' kobor ogħla mill-medja tal-konċentrazzjoni effettiva tad-demm tad-demm fil-bnedmin. Jekk is-solubilità fil-fażi milwiema hija fqira, solvent organiku jista 'jintgħażel bħala s-solvent tagħha, p.e. DMSO, iżda l-ammont ta 'solvent organiku miżjud mas-sistema jeħtieġ li jiġi kkontrollat.
Q ： Fi studji ta 'stabbiltà metabolika, huwa meħtieġ li jintużaw żewġ sistemi tat-test, mikrosomi tal-fwied u epatokiti primarji, għall-ittestjar?
A mikrosomi tal-fwied huma vesicle tal-membrana kważi sferika - bħal strutturi ffurmati mill-awto - fużjoni ta 'retikolu endoplasmiku frammentat miksub waqt l-omoġenizzazzjoni u ċentrifugazzjoni differenzjali ta' tessuti epatiċi, u fihom enzimi CYP450 u xi enzimi bifasiċi, e.g., UGTS, STS. Epatokiti primarji (PHCs) huma epatokiti kkultivati immedjatament wara l-iżolament dirett mill-fwied tal-annimali, li bażikament iżommu l-funzjonijiet metaboliċi tal-fwied, speċjalment li jippreservaw aħjar il-livelli ta 'enzimi konsistenti ma' dawk in vivo. Fl-istudju ta 'stabbiltà metabolika, m'hemmx bżonn li titqies l-ispiża, u żewġ sistemi tat-test jistgħu jintgħażlu għat-test fl-istess ħin; jew is-sistema tat-test xierqa tista 'tintgħażel skond il-proprjetajiet metaboliċi tal-kompost, u l-prinċipju huwa dak li s-sistema għandha rata metabolika għolja hija magħżula. B'mod ġenerali, il-mikrosomi tal-fwied huma l-aħjar għażla meta l-molekuli komposti huma aktar ilma - solubbli u wieħed - Il-metaboliżmu tal-fażi huwa l-passaġġ metaboliku ewlieni (speċjalment permezz ta 'CYP); Meta żewġ metaboliżmu tal-fażi huwa l-mogħdija ewlenija, l-idroliżi hija l-passaġġ metaboliku ewlieni, il-proteina mhux speċifika li torbot fil-mikrosomi tal-fwied hija għolja ħafna, u l-metaboliżmu mhuwiex ovvju fil-mikrosomi tal-fwied, it-test jista 'jitwettaq bl-użu ta' epatokiti primarji.
Q ： Il-konċentrazzjoni ta 'mikrosomi eżaminata fit-test ta' stabbiltà metabolika? X'inhu l-effett ta 'għoli wisq jew baxx wisq?
A ： Fit-test tal-istabbiltà metabolika, il-konċentrazzjoni tal-proteina se taffettwa wkoll ir-rata metabolika, ġeneralment tagħżel il-konċentrazzjoni tal-proteina mikrosomali ta '0.1 mg / ml ~ 1 mg / ml, l-għażla speċifika ta' kemm il-konċentrazzjoni tal-proteina għandha tintgħażel skond il-proprjetajiet metaboliċi tal-kompost stess. Konċentrazzjoni għolja wisq ta 'proteina mikrosomali twassal għal twaħħil mhux speċifiku tal-mediċina mal-proteina mikrosomali; Filwaqt li konċentrazzjoni baxxa wisq ta 'proteina mikrosomali tista' twassal għal metaboliżmu insinifikanti tal-mediċina.