Geïnduceerde rattenlever S9 -fractie: een metabolisch activeringssysteem voor in vitro genotoxiciteit en mutatietests

Sleutelwoorden: OESO 471, OESO 473, OESO 476, OESO 487, mutatietest, genotoxiciteit, genetische toxiciteit, geïnduceerde rattenlever S9, AMES -test, Mini AMES -test, chromosomale aberratie, Micronucleus, HPRT/HGPRT -assay, TK -test

IPhase -product

Invoering

Geïnduceerde rattenlever S9is een belangrijk onderdeel bij het beoordelen van degenetische toxiciteitPotentieel van chemicaliën, vooral in regulerende toxicologie. Het wordt vaak gebruikt in combinatie met in vitro testen, zoals deAmes -test Enmutatietests, om de mutagene eigenschappen van verbindingen te evalueren. Door het enzymatisch systeem te bieden dat rijk is aan cytochroom P450 (CYP450), speelt de geïnduceerde S9 -fractie van de rattenlever een cruciale rol bij het simuleren van de metabole processen die in de lever voorkomen, waardoor chemicaliën mogelijk genetische mutaties of kanker kunnen veroorzaken.

Geïnduceerde rattenlever S9

De lever S9 -fractie verwijst naar een post - mitochondriaal supernatant verkregen uit leverhomogenaten van ratten na een reeks centrifugatiestappen. De term "geïnduceerd" verwijst naar de behandeling van ratten met specifieke verbindingen die de activiteit van leverenzymen verbeteren, met name de cytochroom P450 -enzymen (CYP450), die verantwoordelijk zijn voor het metabolisme van een breed scala van xenobioticum.

De geïnduceerde rattenlever S9 -fractie bevat een verscheidenheid aan enzymen die betrokken zijn bij het metabolisme van fase I en fase II van chemicaliën. Dit omvat enzymen zoals cytochrome P450 monooxygenasen, die oxidatieve biotransformatie van substraten vergemakkelijken, waardoor het menselijke levermetabolisme wordt nagebootst.

CYP450 -activiteit en metabole activering

De cytochroom P450 -enzymfamilie (CYP450) speelt een cruciale rol in het metabolisme van een breed scala aan stoffen, waaronder veel farmaceutische producten, milieuchemicaliën en carcinogenen. De geïnduceerde rattenlever S9 -fractie bevat deze enzymen en is essentieel voor het evalueren van chemicaliën die alleen genotoxisch worden na metabole activering.

Veel verbindingen zijn aanvankelijk niet - giftig, maar kunnen giftig worden na het metabolisme in de lever. Deze pro - mutagenen (waarvoor metabole activering nodig is om mutageen te worden) en pro - carcinogenen (waarvoor activering nodig is om kanker te veroorzaken) kunnen alleen worden gedetecteerd door middel van assays die een S9 -metabolisch activeringssysteem omvatten. Zonder de inductie van metabole enzymen zoals CYP450, kunnen deze stoffen onschadelijk lijken te zijn in standaard genotoxiciteitstests.

Door geïnduceerde rattenlever S9 aan in vitro testen toe te voegen, kunnen onderzoekers beoordelen hoe een stof interageert met de CYP450 -enzymen. Dit is vooral belangrijk voor farmaceutische producten, omdat het metabolisme door CYP450 -enzymen een cruciale stap is in de farmacokinetiek van veel geneesmiddelen.

Toepassingen van geïnduceerde rattenlever S9

1. 1. AMES -test (OESO 471)

De AMES -test, in richtlijn beschrevenOESO 471, is een van de beste - bekende en veelgebruikte methoden voor het beoordelen van mutageniteit. Het omvat het blootstellen van stammen van Salmonella -bacteriën aan een testchemische stof om te zien of het mutaties induceert die ervoor zorgen dat de bacteriën terugkeren naar een histidine - onafhankelijke toestand.

Om het menselijke metabolische proces te simuleren, wordt geïnduceerde rattenlever S9 vaak toegevoegd aan het testsysteem. De S9 -fractie biedt de benodigde enzymen, waaronder CYP450, die nodig kunnen zijn om de verbinding te metaboliseren in een meer reactieve vorm die mutaties in het bacteriële DNA zou kunnen veroorzaken. Deze combinatie van S9 met de AMES -test zorgt voor een meer uitgebreide beoordeling van mutagene potentieel door zowel directe als metabolisch geactiveerde mutagene mechanismen na te bootsen.

2. 2.Mutatietests (chromosomale aberratietest, micronucleustest en andere in vitro testen)

Naast de AMES -test worden mutatietests vaak gebruikt om het genotoxische potentieel van chemicaliën te evalueren. Deze tests zijn uitgebreider bij het beoordelen van een reeks genetische schade, waaronder chromosomale mutaties, genmutaties en de vorming van micronuclei. Geïnduceerde rattenlever S9 wordt gebruikt in mutatietests om de volgende redenen:

Micronucleus -test (OESO 487)

Deze test detecteert de vorming van micronuclei in cellen, die kleine, extranucleaire lichamen zijn die fragmenten van chromosomen of hele chromosomen bevatten die niet in de kern zijn opgenomen tijdens celdeling. De micronucleus -testkan clastogeen (chromosoom - breken) en aneulenische (beïnvloeding van het chromosoomaantal) effecten detecteren. Geïnduceerde rattenlever S9 wordt hier gebruikt om de teststof metabolisch te activeren, omdat sommige chemicaliën alleen chromosomale schade veroorzaken zodra ze zijn gemetaboliseerd door leverenzymen. De S9 -fractie verbetert de gevoeligheid van de test door de metabole activering te simuleren die in vivo kan optreden.

Chromosomale aberratietest (OESO 473)

Deze test evalueert of een stof structurele schade aan chromosomen kan veroorzaken door pauzes, deleties, translocaties of andere soorten aberraties te induceren. Zoals de micronucleus -test, dechromosomale aberratietestkan worden toegepast met of zonder metabole activering. Geïnduceerde rattenlever S9 wordt aan het testsysteem toegevoegd om de metabolische processen in de lever na te bootsen, waardoor stoffen kunnen worden beoordeling die mogelijk geen chromosomale schade in hun oorspronkelijke vorm veroorzaakt, maar dit kan doen na levermetabolisme.

Tabel 1. Vergelijkende overwegingen van mutatietests

HPRT/HGPRT -test (OESO 476)

In deHPRT/HGPRT -test, Culturen van Chinese hamster (Cho of V79) of menselijke lymfoblastoïde (TK6) cellen worden blootgesteld aan de testchemicalie in aanwezigheid van een geïnduceerde S9 -metabolische mix van de rattenlever, die CYP450 -enzymen van CYP450 levert die nodig zijn om pro -mutagens om te zetten in DNA -reactieve soorten. Na een korte behandeling en een periode van zeven dagen worden cellen uitgedaagd met 6 -thioguanine; Alleen klonen die verlies -van -functie mutaties dragen in het hypoxanthine -guanine fosforibosyltransferase -gen overleven. Door het vergelijken van mutante kolonie tellingen met de algehele levensvatbaarheid, bepalen onderzoekers een mutatiefrequentie die, indien reproduceerbaar verhoogd over zowel gelijktijdige als historische controles, het genotoxische potentieel aangeeft.

TK -assays (OESO 490 & OESO 476)

DeTK Assay maakt gebruik van l5178y muis lymfoomcellen (OESO 490) of CHO -cellen (OESO 476) Ontwikkelde heterozygoot op de thymidinekinase -locus. Na chemische blootstelling ± S9 -mix herstellen cellen en worden ze uitgeplaat in medium dat trifluorothymidine bevat, dat Tk -Proficient -cellen doodt. Overlevende TK⁻ -mutanten vormen kolonies gedurende 10-14 dagen, met mutanten met kleine kolonie die vaak chromosomale gebeurtenissen en mutanten met grote kolonie weerspiegelen die puntmutaties reflecteren. Net als in de HPRT/HGPRT -test, zorgen stringente cytotoxiciteitscontroles en positieve mutagenbenchmarks ervoor dat waargenomen toename van de mutatiefrequentie betrouwbaar het genotoxische risico van een verbinding weerspiegelt.

4. 4. Risicobeoordeling van kanker

Geïnduceerde rattenlever S9 wordt ook gebruikt in studies gericht op het beoordelen van de kanker - waardoor het potentieel van stoffen wordt veroorzaakt. Door de metabolische processen die in de menselijke lever optreden te simuleren, kan de S9 -fractie helpen bij het identificeren van verbindingen die kunnen leiden tot de vorming van reactieve metabolieten die in staat zijn om aan DNA te binden en mutaties te veroorzaken die kunnen leiden tot kanker.

Verbeterde AMES -test met geïnduceerde hamster -lever S9

Volgens de nieuwste richtlijnen uitgegeven door het European Medicines Agency (EMA), is de traditionele AMES -test mogelijk niet gevoelig genoeg om het mutagene potentieel van bepaalde N - nitrosamine -onzuiverheden te detecteren, met name N - nitrosodimethylamine (NDMA), onder andere. Daarom is de verbeterde AMES -test, ontwikkeld door het National Center for Toxicological Research (NCTR), een divisie van de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA), aanbevolen als een betrouwbaarder alternatief. De verbeterde AMES -test introduceerde het toevoegen van geïnduceerde hamster -lever S9, die presteerde in het bevatten van 30% rattenlever S9 en 30% hamsterlever S9. Rat en hamster desmosomale supernatanten (S9's) moeten worden bereid uit knaagdierlevers behandeld met cytochroom P450 -enzym - inducerende stoffen. Door geïnduceerde hamster -lever S9 te gebruiken, simuleert deze verbeterde test beter het menselijk metabolisme en verhoogt de betrouwbaarheid van de resultaten.

Conclusie

Geïnduceerde rattenlever S9 dient als een kritisch hulpmiddel bij het testen van genotoxiciteit, waardoor onderzoekers en regulerende agentschappen het mutagene en carcinogene potentieel van chemicaliën beoordelen. Door een metabolisch activeringssysteem te bieden, verbetert het het vermogen van testen zoals de AMES -test, mutatietests en CYP450 -activiteitsstudies om stoffen te detecteren die metabole activering moeten worden genotoxisch. De toepassingen zijn essentieel om de veiligheid van nieuwe geneesmiddelen, chemicaliën en consumentenproducten te waarborgen. Met zijn rol bij het simuleren van het menselijke levermetabolisme, blijft de geïnduceerde S9 -fractie van de rattenlever een onmisbaar onderdeel van de moderne toxicologie en beoordelingen van de regulerende veiligheid.