Primaire hepatocyten: een cruciaal hulpmiddel voor het bevorderen van niet -- klinisch in vitro medicijnonderzoek

Primaire hepatocyten: een cruciaal hulpmiddel voor het bevorderen van niet -- klinisch in vitro medicijnonderzoek

Lever, als het primaire orgaan voor blootstelling aan geneesmiddelen, speelt een cruciale rol in het metabolisme van geneesmiddelen en toxiciteitsprocessen. Primaire hepatocyten bezitten het volledige spectrum van cellulaire kenmerken en fysiologische niveaus van enzymen en cofactoren, waaronder membraan - gebonden enzymen zoals cytochroom p450 (een gemengde - functie -oxidase in het gladde endoplasmatisch reticulum) en cytosolische esterasen, cytosolische eesterasen, die alle metabolische routes in de lever hebben gevonden. Om deze reden worden primaire hepatocyten algemeen beschouwd als de gouden standaard voor het construeren van in vitro levermodellen en worden onderzoekers in de interactie van geneesmiddelen, medicijnmetabolisme en toxiciteitsstudies. Dit artikel biedt een overzicht van 2D- en 3D -cultuurmodellen op basis van primaire hepatocyten en hun toepassingen bij de ontwikkeling van geneesmiddelen.

Sleutelwoorden: primaire hepatocyten, 2D -teelt, 3D -teelt, organoïden, CO - Cultuur.

1. 1. Isolatie van primaire hepatocyten

De isolatie van primaire hepatocyten is een cruciale stap in het vaststellen van in vitro levermodellen, waarbij de twee - stappencollagenase -perfusiemethode de meest gebruikte is. Bij kleinere dieren kan leverperfusie worden uitgevoerd via de portale ader of inferieure vena cava, terwijl grotere dieren meestal perfusie vereisen door leverlobben of segmenten. Verschillende belangrijke factoren beïnvloeden de succesvolle isolatie van hepatocyten: ten eerste moet collagenase niet - cytotoxisch zijn. Ten tweede is de timing van de spijsvertering cruciaal -Zowel onder - Digestie als over - Digestie kan de hepatocytenopbrengst en levensvatbaarheid in gevaar brengen. Ten derde moet de leverconditie optimaal zijn, omdat hepatocyten zeer gevoelig zijn voor ischemische schade. De lever die wordt gebruikt voor de preparaat van hepatocyten moet snel worden afgekoeld om de metabole snelheden te verlagen en metabole hypoxie en daaropvolgende ischemie te voorkomen.

De normen voor primaire hepatocyten die worden gebruikt in drugsonderzoek zijn als volgt:

1. 2. Primaire hepatocyten 2D -cultuur

Het suspensie -hepatocytenmodel

Het bevat compleet medicijn - metaboliserende enzymen en cofactoren, waardoor het geschikt is voor het bestuderen van verschillende metabole klaringsroutes. De levensvatbaarheid van suspensie -hepatocyten en de activiteit van geneesmiddel - metaboliserende enzymen nemen echter geleidelijk af naarmate de in vitro incubatietijd toeneemt, waardoor de incubatietijd beperkt tot maximaal 4 uur. Dit model wordt meestal gebruikt om de klaring van geneesmiddelen met matige tot hoge klaring te schatten. Wanneer het klaringspercentage lager is dan 20%, kunnen nauwkeurige goedkeuringswaarden niet worden bepaald. Traditionele suspensie -hepatocyt - Gebaseerd in vitro -metabolisme -modellen zijn onvoldoende voor het genereren van detecteerbare metabole reacties voor langzame - metaboliserende verbindingen, waardoor hun vermogen om de klaringspercentages en metabole producten van deze verbindingen te voorspellen, beperkt. Een hepatocytenrelaismethode (figuur 1) kan worden gebruikt om de incubatietijd te verlengen tot 20 uur of zelfs langer.

Sollicitatie:Enzymactiviteit en metabole stabiliteitsstudies voor geneesmiddelen voor kleine moleculen.

Figuur 1. Suspensie Hepatocyt Relais Methode Overdrachtsproces

Bron: Drug Metab Dispos, 2012,40 (9): 1860–1865

Het platbare hepatocytenmodel

Primaire hepatocyten worden gekweekt in een 2D -systeem op collageen - gecoate cultuurplaten. De hepatocyten vertonen een epitheliale morfologie, met uitstekende kernen, die vaak in een binucleaire vorm worden gepresenteerd. De nadelen van enkele hepatocyten monolaagcultuur omvatten: 1. Wijziging van celpolariteit en functie.2. Gebrek aan andere relevante celtypen (d.w.z. niet -- parenchymcellen) die nodig zijn voor de normale functie.3. Onvermogen om voldoende voedingsstoffen en paracriene factoren te bieden om de hepatocyten te ondersteunen bij het uitvoeren van hun functies (zoals biosynthese van galzuur en serumeiwit).

Toepassingen:

1). Evaluatie van geneesmiddelen - Drugsinteracties:Dit omvat enzyminductie, remming van enzym en transporterstudies. Ten eerste, wanneer een medicijn als een inductor fungeert, kan dit leiden tot verhoogde expressie van geneesmiddel - metaboliserende enzymen en transporters. Sterke inductoren kunnen meerdere genen tegelijkertijd opreguleren, zoals fenobarbitale inductie van CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9, UGT en verschillende transporteiwitten zoals MRP2. Ten tweede zijn er soorten - specifieke verschillen in hoe hepatocyten reageren op inductoren. Rifampicine is bijvoorbeeld een effectieve inductor voor hepatocyten van menselijke en konijnen, maar heeft geen inductie -effect op hepatocyten van ratten. Ten slotte kan suboptimale plateringsdichtheid van platte hepatocyten leiden tot verminderde basale expressie van P450's en kunstmatig verhoogde inductiereacties. Zoals getoond in figuur 3 vertonen hepatocyten bij lagere platedichtheden een lagere basale activiteit van CYP1A2, CYP2B6 en CYP3A4, maar sterkere inductiereacties. Daarom zijn gezonde hepatocyten bij een geschikte plating -dichtheid nodig om fysiologisch relevante gegevens te verkrijgen.

Figuur 2. Relatie tussen plating -dichtheid van cryopreserveerde menselijke hepatocyten en enzyminductie

Bron: Huidige Drug Discovery Technologies, 2010, 7: 188 - 198

2). Hepatotoxiciteitsbeoordeling: Morfologische veranderingen observeren onder een lichtmicroscoop, zoals celmorfologie, vacuole en lipidedruppelaggregatie en celhechting/detachement. Detectie van hepatocytennecrose (zoals aangegeven door aspartaataminotransferase, lactaatdehydrogenase en alanineaminotransferase) en apoptose (DNA -fragmentatie). Voor cytokine - gemedieerde cytotoxiciteit kunnen enkele monolaagkweken van hepatocyten geen toxische responsen voorspellen als gevolg van de regulatie door stoffen die worden vrijgegeven uit aangrenzende niet -- parenchymale cellen, zoals kupffercellen, stellaire cellen en sinusoïdale endotheelcellen.

3). "Relaismethode" voor het bestuderen van langzame metaboliserende samengestelde klaring en zijn metabolieten: De activiteit van het medicijn - metaboliserende enzymen in platte hepatocyten begint na 24 uur plateren af ​​te nemen. Na het incuberen van geplunderbare hepatocyten met serum - Vrij medium dat 24 uur de belangstelling bevat, wordt het medium verzameld en gemengd en vervolgens overgebracht naar nieuwe platbare hepatocyten voor verder onderzoek (figuur 3).

Figuur 3. Platable Hepatocyt Relay Method Transfer Proces

Bron: Drug Metabolism Letters, 2016, 10: 3 - 15

3). Evalueer de cellulaire opname, endocytose, endosomale ontsnapping en silencing -effecten op het doelgen van hepatocyten - gerichte kleine nucleïnezuurgeneesmiddelen.

Sandwich teeltmodel

In vitro kunnen hepatocyten worden gekweekt tussen twee lagen collageen of matrigel om in vivo structuren te reconstrueren, bekend als sandwich teelt. Hepatocyten gekweekt tussen twee lagen gel - collageen (sandwichstructuur) kunnen de morfologie en levensvatbaarheid van de cellen verbeteren en hun functionaliteit voor een langere periode behouden. Bovendien kunnen hepatocyten in de sandwichkweek de polariteit herstellen, waardoor de juiste lokalisatie van basolaterale en canaliculaire transporters mogelijk is, evenals de vorming van functionele galwegennetwerken (figuur 4).

Figuur 4. Gepolariseerde expressie van transporters in het sandwichmodel van het humaan hepatocyten

Bron: Huidige Drug Discovery Technologies, 2010, 7, 188 - 198

Toepassingen:

1. 1). Biliaire uitschatting van verbindingen schatten.
2. 2). Evaluatie van de lever- en galverdeling van endogene en exogene verbindingen en metabolieten.
3. 3). Het schatten van klaring gemedieerd door metabolisme en transporters en het construeren van fysiologie - gebaseerde farmacokinetische modellen.
4. 4). Hepatotoxiciteit bestuderen en mechanismen bieden voor klinisch medicijn - geïnduceerd leverbeschadiging. Gegevens worden geïntegreerd in systemen farmacologiemodellen om potentieel medicijn te voorspellen - geïnduceerd leverbeschadiging bij mensen.
5.  
   1. 3. Primaire hepatocyten 3D -cultuur

6. In 3D -cultuursystemen worden hepatocyten gekweekt in een drie - dimensionale matrix, die de in vivo leverarchitectuur beter nabootsen in vergelijking met 2D -monolaagculturen. Deze systemen bevorderen cel - cel- en cel - matrix -interacties, die meer van de fysiologische functies van de lever kunnen herstellen, waaronder medicijnmetabolisme, eiwitsecretie en galvorming. Primaire hepatocyten 3D -culturen kunnen worden gebruikt om lever te bestuderen - Specifieke functies in een meer in vivo - zoals de omgeving, die voordelen bieden voor het testen van drugs, toxiciteitsbeoordeling en ziektemodellering.

   Sferoïde model

Door middel van technieken zoals ultra - lage gehechtheidskweek, hangende druppelcultuur en magnetische celkweek (figuur 5), kunnen primaire hepatocyten aggregeren in sferoïdale aggregaten met een diameter van maximaal 150 - 175 µm zonder te vertrouwen op externe matrices. Een voordeel van sferoïde cultuur is dat elke sferoïde slechts 1.330 - 2.000 cellen vereist, waardoor het aantal cellen aanzienlijk wordt verminderd in vergelijking met andere 3D -kweektechnieken. Recente studies hebben aangetoond dat primaire hepatocyten sferoïde culturen maximaal 5 weken kunnen handhaven, waarbij CYP -enzymactiviteit bijna ongewijzigd blijft tussen dag 8 en dag 35. Proteomics -analyse onthulde dat, vergeleken met sandwichkweek, enzymen die verantwoordelijk zijn voor de absorptie van geneesmiddelen, distributie, metabolisme en excretie beter zijn voor 14 dagen in de spiroïde kweek. De lever is echter veel complexer dan een celaggregaat. De basolaterale zijde van hepatocyten interageert met bloed, terwijl gal uit de apicale zijde stroomt, wat een belangrijk kenmerk is van de complexe leverlobule -structuur, en dit kan nog niet worden gerepliceerd in het sferoïde model.

Toepassingen:

1. 1). Studie van langzame metaboliserende samengestelde klaring en zijn metabolieten.
2. 2). Hepatotoxiciteitsonderzoek.
3. 3). Evaluatie van cellulaire opname, endocytose, endosomale ontsnapping en silencing -effecten op doelgenen van hepatocyten - gerichte kleine nucleïnezuurgeneesmiddelen.

Figuur 5. Spheroïde kweekmethode

Lever organoïden model

De consensusdefinitie van organoïden is: 3D -structuren afgeleid van stamcellen, voorlopercellen of gedifferentieerde cellen, die in staat zijn om bepaalde functies en structuren van het natieve weefsel in vitro te reproduceren, waardoor het in vivo micro -omgeving en cellen effectief nabootst. Leverorganoïden zijn geïdentificeerd als het meest geavanceerde model voor onderzoek naar menselijk leverbiologie.

Celbronnen voor leverorganoïde constructie:

① Pluripotente stamcellen (PSC's):

Embryonale stamcellen (ESC's) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) hebben een hoge pluripotentie, plasticiteit en onbeperkte proliferatieve capaciteit. Onder invloed van specifieke signaalfactoren differentiëren ze in hepatocyten - zoals cellen met activiteit en functie. Leverorganoïden afgeleid van PSC's kunnen echter epigenetische en genetische veranderingen ondergaan, die chromosomale aneuploïdie -veranderingen vertonen tijdens amplificatie.

Toepassingen:

1. 1). Genetische leverziekte modellen
2. 2). Infectieuze leverziekte modellen
3. 3). Cytotoxiciteitstests voor geneesmiddelen

② Leverweefsel - afgeleide cellen: deze omvatten cholangiocyten en hepatocyten. Rijpe hepatocyten behouden stamcelpotentieel en proliferatief vermogen in specifieke omgevingen. Vergeleken met PSC - afgeleide organoïden, zijn organoïden afgeleid van primair weefsel volwassener, met stabielere genomen, en handhaven ze fenotypische en genetische stabiliteit tijdens lange - term in vitro kweek. De langdurige proliferatieve capaciteit van volwassen menselijke hepatocytenorganoïden is echter beperkt in vergelijking met foetale menselijke hepatocyten of volwassen muis primaire hepatocyten. Het kweken van volwassen hepatocytorganoïden blijft een uitdaging.

Kweekmethode (figuur 6): leverweefsel wordt gedigereerd in enkele cellen en een mengsel van matrigel en cellen wordt gezaaid in een 24 - putplaat om koepel - gevormde structuren te vormen. Incubeer gedurende 15 minuten in een celkweekincubator (37 ° C). Voeg na stolling een specifiek kweekmedium toe. Doorgang na ongeveer 14 dagen. Vervang het originele medium door differentiatiemedium na 7 - 10 dagen.

Toepassingen:

1. 1). Hepatotoxiciteitsmodellen
2. 2). In vitro metabolisme stoornisstudies
3. 3). Niet - alcoholische leverziekte
4. 4). Drugsontwikkeling voor goedaardige en kwaadaardige leverziekten

Figuur 6. Cultuur- en doorgangsproces van weefsel - afgeleide leverorganoïden

Bron: Cell & Bioscience (2023) 13: 197

Vergelijking van sferoïde cultuur en organoïde cultuur

4. Primaire hepatocytenco - Cultuurmodel

1. 1. 2D Primaire Hepatocyte Co - Cultuurmodel
      

      In het 2D Primary Hepatocyte Co - Culture -model worden twee of meer verschillende celtypen gemengd en gekweekt in een twee - dimensionale omgeving. Het belangrijkste kenmerk van dit model is de directe interactie tussen verschillende celtypen, de interactie tussen cellen en de extracellulaire matrix of de indirecte signaaltransmissie via cytokines en chemische communicatie. Primaire hepatocytenfuncties, zoals het vermogen van albumine en het vermogen van het medicijnmetabolisme, kunnen tot drie weken worden gehandhaafd.

      Toepassingen:

      1. 1). Primaire hepatocyten CO - Gekweekt met fibroblasten: dit model wordt gebruikt voor het bestuderen van de klaring van langzame - metaboliserende verbindingen en hun metabolieten.
      2. 2). Primaire hepatocyten CO - Gekweekt met niet -- parenchymale levercellen (bijv. Stellaatcellen, sinusvormige endotheelcellen): dit model is nuttig voor het onderzoeken van geneesmiddelen - Geïnduceerd leverbeschadiging (DILI), omdat het helpt om de rol van cytokines, chemokines en groeifactoren te moduleren in de loop van de lever van de leververhoorse reacties na de blootstelling aan geneesmiddelen.
      3. 3). Primaire hepatocyten CO - Gekweekt met T -cellen: dit model wordt gebruikt om het metabolisme van het lever medicijn te detecteren - Specifieke T -celreacties.
      4. 4). IPhase's Hepatomax ™CO - Cultuursysteem: Iphase heeft een CO - kweeksysteem ontwikkeld met primaire hepatocyten van verschillende soorten, bekend als hepatomax™. Door het kweken van menselijke primaire hepatocyten met stromale cellen, is het mogelijk om een ​​goed medicijn te behouden - metaboliseren enzymactiviteit in menselijke hepatocyten gedurende maximaal 3 weken. Dit systeem is geschikt voor het bestuderen van langzame - metaboliserende samengestelde klaringsnelheden en hun metabolieten.

      Dit CO - kweekmodel biedt een meer fysiologisch relevant platform voor het beoordelen van medicijnmetabolisme, toxiciteit en lever - gerelateerde ziekteprocessen, en biedt inzichten in hoe verschillende celtypen bijdragen aan de leverfunctie en ziekte.
      
      

      3D Primary Hepatocyte Co - Cultuurmodel

      Direct 3D Co - Cultuur: Dit model omvat het mengen van twee of meer verschillende soorten levercellen (bijv. Primaire hepatocyten, sinusoïdale endotheelcellen, hepatische stellaatcellen, kupffer -cellen) om zelf te vormen - geassembleerde sferoïden of co - ze kweken in een 3D -omgeving die is geconstrueerd met materialen zoals collageen, fibrine, alginaat, alginaat, alginaat, alginaten, alginaat, algegeren, alginaat, algegeren, of hydrogels. Directe 3D Co - Kweek maakt nauwe interactie tussen verschillende levercellen mogelijk door mechanismen zoals cel - tot - celadhesie, paracrinesignalering via oplosbare cytokines en extracellulaire matrixadhesie, waardoor communicatie tussen hepatocyten mogelijk wordt.

      Toepassingen:

      1. 1). Leverfibrosemodel: gebruikt om de mechanismen en progressie van leverfibrose te bestuderen.
      2. 2). Geneesmiddel - Geïnduceerd leverletsel (DILI) Model: helpt leverschade te simuleren en te beoordelen veroorzaakt door medicijnen.
      3. 3). Geneesmiddelinteracties, medicijnmetabolisme en enzyminductie: evalueert hoe verschillende geneesmiddelen op elkaar inwerken, hoe ze worden gemetaboliseerd en hoe ze leverenzymen induceren.

      Indirect 3D Co - Cultuur: Deze methode maakt gebruik van een fysiek scheidingssysteem (bijv. Transwell of andere materialen) om twee of meer soorten cellen te kweek (zoals primaire hepatocyten met NIH/3T3 -cellen of sinusvormige endotheliale cellen) in een 3D -omgeving, waarbij directe cel - celcontact wordt voorkomen. De communicatie tussen de cellen vindt plaats via oplosbare cytokines.

      Toepassingen:
      Gebruikt voor het bestuderen van niet -- contactcommunicatie tussen levercellen in het lichaam.

      
      Samenvattend biedt iPhase, als leider in in vitro biologisch onderzoek, uitgebreide oplossingen voor niet -- klinische drugstests. Van de isolatie en cultuur van primaire hepatocyten van verschillende soorten tot de ontwikkeling van ondersteunende producten zoals cultuurmedia voor specifieke toepassingen of multi - specificatie collageen - gecoate platen, IPHase is toegewijd aan het bieden van de beste in vitro onderzoekstools voor drugsontdekking en -ontwikkeling. Wij zijn een vertrouwde partner voor klanten in de farmaceutische industrie, toegewijd aan het leveren van snijoplossingen voor niet -- klinisch onderzoek.