Spørsmål: Hvordan skal jeg velge mikrosomer og hepatocytter for metabolske stabilitetsstudier? Kan jeg bare velge en av dem for å oppfylle kravet?
A: I metabolsk stabilitetsstudie avhenger valget av levermikrosomer eller hepatocytter hovedsakelig av metabolske egenskaper til forbindelsene, hvor den med høy metabolsk hastighet er valgt. Generelt er levermikrosomer foretrukket, spesielt når de sammensatte molekylene er mer vann - oppløselige og en - fase metabolisme er den viktigste metabolske banen (spesielt via CYP). Hepatocytter kan brukes til eksperimenter når det er bevis på to - fase metabolisme som hovedvei, hydrolyse som den viktigste metabolske banen, høy ikke -spesifikk proteinbinding i levermikrosomer, og metabolisme i levermikrosomer er ikke tydelig. Vanligvis kan ett metabolsk system velges for å imøtekomme behovene; Hvis forholdene i alle aspekter tillater det, er det definitivt best å velge begge systemene samtidig.
Spørsmål: Hvorfor er det nødvendig å bruke primære hepatocytter for enzyminduksjonsanalyse?
A: CYP -enzym - Indusert analyse må gå fra "transkripsjon", "oversettelse" til "Post - Translasjonsmodifisering av protein" for å oppnå et aktivt CYP -enzymprotein. Derfor bør testsystemet være leverceller, ikke levermikrosomer eller lever S9.
Spørsmål: Hvorfor trenger jeg å velge tre donor -primære hepatocytter for enzyminduksjonsanalysen?
A: I henhold til introduksjonen til retningslinjene for medikamentinteraksjoner, bør minst tre givere brukes, og induksjonsresultatet av hver giver bør evalueres separat. I tillegg til å produsere statistisk signifikante resultater, er valget av tre givere for eksperimentet også viktigere for å vurdere inter - individuell variasjon. Hvis resultatet fra minst en giver overstiger en forhåndsbestemt terskel, kan medikamentkandidaten være induserbar og følge - opp evaluering er nødvendig.
Spørsmål: Hvorfor fokuserer bare på CYP -enzyminduksjon og ikke på UGT -enzyminduksjon?
A: Årsaken til å fokusere på cypaseinduksjon er at mekanismen for cypaseinduksjon er blitt studert tydeligere. Med andre ord, grunnen til ikke å kreve studie av UGTase -induksjon er at mekanismen fremdeles er uklar; Dette betyr imidlertid ikke at UGTase ikke vil bli indusert. Retningslinjene sier også at det ikke er noe standardisert klassifiseringssystem for indusere eller hemmere av transportører og fase II -metabolisme -enzymer.
Spørsmål: Hvor lenge kan vedheftende primære hepatocytter overleve etter gjenopplivning, og hvor lenge kan hepatocytter opprettholdes uten adherent kultur etter gjenopplivning?
A: Pasteurisert primære hepatocytter brukes vanligvis til enzyminduksjonsanalyser. Etter cellegjenvinning blir celler suspendert i platespredningsmedium, justert til passende konsentrasjon og dyrket i kollagen - belagte plater; Deretter kan celler pasteuriseres innen 4 ~ 6 timer. Etter at cellene er festet til veggen, erstattes og vedlikeholdes vedlikeholdsmediet i 18 timer for å sikre maksimal restaurering av celletilstand. Deretter kan enzyminduksjonsanalyse utføres for å oppdage metabolsk aktivitet og mRNA -induksjonsnivå. Fra perspektivet til hele syklusen kan hepatocytter opprettholdes i 6 ~ 7 dager etter vegghøyde. Etter hvert som tiden går, forverres celleveggen, og cellene vil løsne og suspendere.
Hvis de tilhørende hepatocyttene ikke er dyrket, har vi bekreftet at de kan opprettholdes i god tilstand innen 4 ~ 6 timer. Vi har ennå ikke utført verifisering i en lengre periode.
Spørsmål: Hepatocytter kan brukes som både suspensjon og tilhørende celler avhengig av de forskjellige kulturmediene som brukes?
A: De fleste celler fra fast vev og organer er inngjerdet, men ikke alle celler er inngjerdet når de dyrkes i - vitro. Om cellene er vegg - vedheftende eller ikke avhenger av tilstanden til celler selv; Samtidig trenger vegg - adherende celler spesifikt kulturmedium og noen spesielle pro - celleadhesjonsstoffer (f.eks. Rhamnogelinogen, laminin, fibronektin, serumekspansjonsfaktor) som kan delta i prosessen med cellefeste. Avslutningsvis kan adherente celler brukes som suspensjonsceller, men suspensjonsceller er ikke nødvendigvis tilgjengelige for adherent bruk.
Spørsmål: Hva er fordelene/ulempene ved å bruke vedheftende veggvers fra opphengshepatocytter? Hva er beslutningskriteriene?
A: Etter at hepatocytter er isolert, kan de dyrkes i suspensjon eller i vedfølgende vegg. Aktiviteten til cytokrom P450 -enzym fra suspensjon av dyrket primær hepatocytter er mest konsistent med den i - vivo for de første 4 ~ 6H, og avtar deretter raskt med forlengelsen av tid. Derfor brukes suspensjonshepatocytter vanligvis til metabolsk stabilitetsstudie eller metabolittprofileringsstudie. Primære hepatocytter som er dyrket i adherent vegg har tilstrekkelig tid til å komme seg etter skade for å opprettholde de biologiske egenskapene og metabolske aktiviteten til normale hepatocytter. Derfor brukes de vanligvis til enzyminduksjonsstudier, medikamentcytotoksisitetsstudier, metabolsk stabilitet av langsomme metaboliserende medikamenter eller produktinndiftelsesstudier.
Foreløpig tilbyr vi ikke webside online kjøpstjeneste. Produktene som er lagt til handlekurven etter registrering og pålogging er kun som referanse. Hvis du trenger å kjøpe produktene våre, kan du legge igjen kontaktinformasjonen din gjennom kontakt -kanalen, så kontakter vi deg i tide for å fullføre tjenestene våre.
Q ： Hvordan påvirker ikke - Spesifikk proteinbinding testresultater?
A ： Hvis medikamentkandidaten binder ikke - spesifikt til mikrosomale proteiner, resulterer dette i endrede kinetiske parametere. Når proteinkonsentrasjonen øker, øker KM -verdien, noe som resulterer i en lav antatt egen clearance. Bindingen av medikamentkandidaten til proteiner i mikrosomer kan også føre til store variasjoner i resultater fra forskjellige laboratorier og forskjellige systemer.
Q ： Den anbefalte konsentrasjonen av levermikrosomalt protein i bruksanvisningen av fase I eller fase II metabolsk stabilitetssett er 0,1 mg/ml - 1 mg/ml, betyr dette at når du bruker levermikrosomer, er det fortsatt nødvendig å fortynne dem godt før du legger dem til systemet?
EN: Det er ikke nødvendig å fortynne levermikrosomene først; Konsentrasjonen av levermikrosomer i settet er 20 mg/ml og den endelige konsentrasjonen av levermikrosomer i testsystemet er 0,1 - 1 mg/ml, som kan tilsettes proporsjonalt.
Q ： Hva er den anbefalte celletettheten for metabolsk stabilitetstesting av primære hepatocytter? Er clearance -beregningen den samme som for levermikrosomer?
A ： Den anbefalte celletettheten for den primære hepatocyttmetabolske stabilitetsanalysen er 0,5 til 2 × 106 Celler/ml, og clearance -beregningene og behandlingen av resultatene av levermikrosomal metabolsk stabilitetsanalyse er konsistente.
Q ： Hva er hovedingrediensene i PBS -bufferen din? Inneholder den KCl og NaCl?
A ： Hovedkomponentene i vår PBS -buffer er k2Hpo4 og kh2PO4, og er fri for KCL og NaCl.
Q ： Hva er formålet med fosfatbuffere? Hvorfor trenger du fosfat?
A ： Fosfatbuffere er valgt for deres formål å etterligne det fysiologiske miljøet, og fosfat er et av de viktigste bufferparene for å opprettholde kroppens flytende miljø.
Q ： Hva er den vanlige innstillingen for enzym - indusert reseptorkonsentrasjon? Er det noen løsning hvis løseligheten til systemet som skal testes er dårlig?
A ： Enzyminduksjonsanalysen må settes opp med 3 forskjellige konsentrasjoner, konsentrasjonsnivået må dekke den forventede effektive blodmedisinsk konsentrasjonen hos mennesker, og den høyeste konsentrasjonen er valgt for å være minst en størrelsesorden høyere enn den gjennomsnittlige effektive blodmedisinsk konsentrasjonen hos mennesker. Hvis løseligheten i den vandige fasen er dårlig, kan et organisk løsningsmiddel velges som dets løsningsmiddel, f.eks. DMSO, men mengden organisk løsningsmiddel som er lagt til systemet, må kontrolleres.
Q ： I metabolske stabilitetsstudier, er det nødvendig å bruke to testsystemer, levermikrosomer og primære hepatocytter, til testing?
A ： levermikrosomer er nesten sfærisk membranvesikkel - som strukturer dannet av selvet - fusjon av fragmentert endoplasmatisk retikulum oppnådd under homogenisering og differensialsentrifugering av levervev, og inneholder CYP450 -enzymer og litt biphasic enzym, E.G.G.G.G.G.G.G.G.G.G.G.G.G.G. Primære hepatocytter (PHCs) er hepatocytter dyrket umiddelbart etter direkte isolasjon fra dyreelever, som i utgangspunktet opprettholder leverens metabolske funksjoner, spesielt bedre å bevare enzymnivået som er i samsvar med de in vivo. I metabolsk stabilitetsstudie er det ikke nødvendig å vurdere kostnadene, og to testsystemer kan velges for testen samtidig; eller det aktuelle testsystemet kan velges i henhold til de metabolske egenskapene til forbindelsen, og prinsippet er at hvilket system som har en høy metabolsk hastighet er valgt. Generelt er levermikrosomer det beste valget når forbindelsesmolekylene er mer vann - oppløselig og en - fase metabolisme er den viktigste metabolske banen (spesielt via CYP); Når to - Fasemetabolisme er hovedveien, er hydrolyse den viktigste metabolske banen, ikke - Spesifikk proteinbinding i levermikrosomene er veldig høy, og metabolismen er ikke åpenbar i levermikrosomene, testen kan utføres ved bruk av primære hepatocytter.
Q ： Er konsentrasjonen av mikrosomer undersøkt i den metabolske stabilitetstesten? Hva er effekten av for høy eller for lav?
A ： I den metabolske stabilitetstesten vil proteinkonsentrasjonen også påvirke metabolsk hastighet, velg vanligvis den mikrosomale proteinkonsentrasjonen på 0,1 mg/ml ~ 1 mg/ml, det spesifikke valget av hvor mye proteinkonsentrasjon som skal velges i henhold til forbindelses egen metabolske egenskaper. For høy konsentrasjon av mikrosomalt protein vil føre til ikke - spesifikk binding av medikamentet til det mikrosomale proteinet; Mens for lav konsentrasjon av mikrosomalt protein kan føre til ubetydelig metabolisme av medikamentet.