P: Jak powinienem wybrać mikrosomy i hepatocyty do badań stabilności metabolicznej? Czy mogę wybrać tylko jeden z nich, aby spełnić ten wymóg?
Odp.: W badaniu stabilności metabolicznej wybór mikrosomów wątroby lub hepatocytów zależy głównie od właściwości metabolicznych związków, w których wybierany jest ten o wysokiej szybkości metabolizmu. Zasadniczo preferowane są mikrosomy wątroby, szczególnie gdy cząsteczki złożone są bardziej woda - rozpuszczalne, a jeden metabolizm fazowy jest głównym szlakiem metabolicznym (szczególnie przez CYP). Hepatocyty mogą być stosowane do eksperymentów, gdy istnieją dowody na dwa - metabolizm fazowy jako główny szlak, hydroliza jako główna szlak metaboliczny, duże niespecyficzne wiązanie białka w mikrosomach wątroby i metabolizm w mikrosomach wątroby nie jest widoczny. Zwykle można wybrać jeden system metaboliczny w celu zaspokojenia potrzeb; Jeśli warunki we wszystkich aspektach pozwalają na z pewnością najlepiej wybrać oba systemy jednocześnie.
P: Dlaczego konieczne jest stosowanie pierwotnych hepatocytów do testu indukcyjnego enzymu?
Odp.: Test indukowany CYP - Indukowany musi przejść od „transkrypcji”, „tłumaczenia” na „Post - Modyfikację translacyjną białka”, aby uzyskać aktywne białko enzymatyczne CYP. Dlatego systemem testowym powinny być komórki wątroby, a nie mikrosomy wątroby lub wątroba S9.
P: Dlaczego muszę wybrać trzy główne hepatocyty ludzkich ludzkich ludzkich do testu indukcyjnego enzymu?
Odp.: Zgodnie z wprowadzeniem do wytycznych dotyczących interakcji związanych z lekami należy zastosować co najmniej trzech dawców, a wynik indukcji każdego dawcy należy ocenić osobno. Oprócz dania statystycznie istotnych wyników, wybór trzech dawców do eksperymentu jest również ważniejszy dla oceny między indywidualnymi zmiennością. Jeśli wynik co najmniej jednego dawcy przekroczy z góry określony próg, kandydat na leki może być indukowany i wymagana jest ocena.
P: Po co skupiać się tylko na indukcji enzymu CYP, a nie na indukcji enzymu UGT?
Odp.: Powodem skupienia się na indukcji cypazy jest to, że mechanizm indukcji cypazy był bardziej badany. Innymi słowy, powodem, dla którego nie wymaga badania indukcji UGTazy, jest to, że mechanizm jest nadal niejasny; Nie oznacza to jednak, że UGTaza nie zostanie indukowana. Wytyczne stwierdzają również, że nie ma znormalizowanego systemu klasyfikacji induktorów lub inhibitorów transporterów i enzymów metabolizmu fazy II.
P: Jak długo przylegające pierwotne hepatocyty mogą przetrwać po resuscytacji i jak długo można zachować hepatocyty bez kultury przylegającej po reanimentacji?
Odp.: Pasteryzowane pierwotne hepatocyty są ogólnie stosowane do testów indukcji enzymów. Po odzyskaniu komórek komórki są zawieszone w pożywce rozprzestrzeniania płyt, dostosowywane do odpowiedniego stężenia i hodowane w płytkach pokrytych kolagenem; Następnie komórki można pasteryzować w ciągu 4 ~ 6 godzin. Po przymocowaniu komórek do ściany pożywka konserwacyjna jest zastąpiona i utrzymywana przez 18 godzin, aby zapewnić maksymalne przywrócenie stanu komórkowego. Następnie można przeprowadzić test indukcji enzymu w celu wykrycia aktywności metabolicznej i poziomu indukcji mRNA. Z perspektywy całego cyklu hepatocyty można utrzymywać przez 6 ~ 7 dni po przyleganiu ściany. W miarę upływu czasu stan przestrzegania ściany komórkowej pogarsza się, a komórki odłączą się i zawiesi.
Jeśli przylegające hepatocyty nie są hodowane, sprawdziliśmy, że można je utrzymać w dobrym stanie w ciągu 4 ~ 6 godzin. Nie przeprowadziliśmy jeszcze weryfikacji przez dłuższy okres.
P: Hepatocyty mogą być stosowane zarówno jako zawieszenie, jak i przylegające komórki w zależności od różnych zastosowanych pożywek hodowlanych?
Odp.: Większość komórek z tkanek stałych i narządów jest ścianowana, ale nie wszystkie komórki są ścianowane po hodowaniu w - vitro. To, czy komórki są ściany - przylegające, czy nie, zależy od samego stanu komórek; Jednocześnie komórki ściany - przylegające komórki potrzebują określonej pożywki hodowlanej i niektórych specjalnych substancji adhezji komórek (np. Rhamnogelinogen, laminina, fibronektyna, czynnik ekspansji w surowicy), który może uczestniczyć w procesie przyłączenia komórek. Podsumowując, przylegające komórki mogą być stosowane jako komórki zawieszenia, ale komórki zawiesiny niekoniecznie są dostępne do przylegającego stosowania.
P: Jakie są zalety/wady stosowania adherentnych hepatocytów w wersach ścianowych? Jakie są kryteria decyzyjne?
Odp.: Po izolowaniu hepatocytów można je hodować w zawiesinie lub w przylegającej ścianie. Aktywność enzymu cytochromu P450 z zawiesiny hodowanych pierwotnych hepatocytów jest najbardziej spójna z aktywnością in - vivo przez pierwsze 4 ~ 6H, a następnie gwałtownie spada wraz z przedłużeniem czasu. Dlatego hepatocyty zawieszenia są ogólnie stosowane do badania stabilności metabolicznej lub badania profilowania metabolitów. Pierwotne hepatocyty hodowane w przylegającej ścianie mają wystarczającą ilość czasu na wyzdrowienie po uszkodzeniu w celu utrzymania cech biologicznych i aktywności metabolicznej normalnych hepatocytów. Stąd są one ogólnie stosowane do badań indukcyjnych enzymów, badań cytotoksyczności leków, stabilności metabolicznej wolnych leków metabolizujących lub badań wnioskowania produktu.
Obecnie nie zapewniamy usługi zakupu online. Produkty dodane do koszyka po rejestracji i logowaniu są tylko w celach informacyjnych. Jeśli chcesz kupić nasze produkty, zostaw dane kontaktowe za pośrednictwem kanału kontaktowego, a my skontaktujemy się z Tobą na czas, aby wypełnić nasze usługi.
P ： W jaki sposób niezatystyczne wiązanie białka wpływa na wyniki testu?
A ： Jeśli kandydat na leku wiąże się z białkami mikrosomalne, powoduje to zmienione parametry kinetyczne. Wraz ze wzrostem stężenia białka wartość km wzrasta, co powoduje niski, przypuszczalny klirens wewnętrzny. Również wiązanie kandydata leku z białkami w mikrosomach może powodować duże różnice w wynikach różnych laboratoriów i różnych systemów.
Q ： Zalecane stężenie białka mikrosomalnego wątroby w instrukcji instrukcji fazy I lub zestawu stabilności metabolicznej fazy II wynosi 0,1 mg/ml - 1 mg/ml, czy to oznacza, że przy użyciu mikrosomów wątroby jest nadal konieczne do ich rozcieńczenia przed dodaniem ich do systemu?
A: Nie ma potrzeby najpierw rozcieńczania mikrosomów wątrobowych; Stężenie mikrosomów wątrobowych w zestawie wynosi 20 mg/ml, a końcowe stężenie mikrosomów wątrobowych w układzie testowym wynosi 0,1 - 1 mg/ml, które można dodać proporcjonalnie.
P ： Jaka jest zalecana gęstość komórek do testowania stabilności metabolicznej pierwotnych hepatocytów? Czy obliczenie klirensu jest to samo, co w przypadku mikrosomów wątroby?
A ： Zalecana gęstość komórki dla pierwotnego testu stabilności metabolicznej hepatocytów wynosi 0,5 do 2 × 106 Komórki/ml oraz obliczenia klirensu i przetwarzanie wyników wątroby mikrosomalnej testu stabilności metabolicznej są spójne.
P ： Jakie są główne składniki w buforze PBS? Czy zawiera KCl i NaCl?
A ： Główne elementy naszego bufora PBS to k2HPO4 i KH2PO4i są wolne od KCl i NaCl.
P ： Jaki jest cel buforów fosforanowych? Dlaczego potrzebujesz fosforanu?
A ： Bufory fosforanowe są wybierane w celu naśladowania środowiska fizjologicznego, a fosforan jest jedną z najważniejszych par buforowych do utrzymania środowiska płynnego organizmu.
P ： Jakie jest zwykłe ustawienie dla enzymu - indukowane stężenie receptora? Czy istnieje jakieś rozwiązanie, jeśli rozpuszczalność systemu do testowania jest słaba?
A ： Test indukcyjny enzymu należy ustawić z 3 różnymi stężeniami, poziom stężenia musi pokryć oczekiwane skuteczne stężenie leku we krwi u ludzi, a najwyższe stężenie wynosi co najmniej jeden rzędu wielkości większy niż średnie skuteczne stężenie leku krwi u ludzi. Jeśli rozpuszczalność w fazie wodnej jest słaba, można wybrać rozpuszczalnik organiczny jako jego rozpuszczalnik, np. DMSO, ale ilość rozpuszczalnika organicznego dodana do systemu musi być kontrolowana.
P ： W badaniach stabilności metabolicznej konieczne jest zastosowanie dwóch systemów testowych, mikrosomów wątroby i pierwotnych hepatocytów do testowania?
A ： Mikrosomy wątrobowe są prawie sferycznymi pęcherzykami błonowymi - podobnymi strukturami utworzonymi przez samooceny fragmentarycznego retikulum endoplazmatycznego uzyskanego podczas homogenizacji i różnicowego wirowania tkanek wątrobowych i zawierają enzymy CYP450 i niektóre enzymy biphazowe, np. Pierwotne hepatocyty (PHC) to hepatocyty hodowane natychmiast po bezpośredniej izolacji z wątroby zwierzęcych, które zasadniczo utrzymują funkcje metaboliczne wątroby, szczególnie lepiej zachowanie poziomów enzymów zgodnych z tymi in vivo. W badaniu stabilności metabolicznej nie ma potrzeby rozważania kosztów, a jednocześnie można wybrać dwa systemy testowe; lub odpowiedni system testowy można wybrać zgodnie z właściwościami metabolicznymi związku, a zasadą jest wybór systemu wysokiej szybkości metabolizmu. Zasadniczo mikrosomy wątroby są najlepszym wyborem, gdy cząsteczki złożone są bardziej woda - rozpuszczalne, a jeden metabolizm fazowy jest głównym szlakiem metabolicznym (szczególnie przez CYP); Gdy głównym szlakiem hydrolizy jest głównym metabolizmem - fazowym, hydroliza jest głównym szlakiem metabolicznym, nieokreślone wiązanie białka w mikrosomach wątroby jest bardzo wysokie, a metabolizm nie jest oczywisty w mikrosomach wątroby, test można przeprowadzić przy użyciu pierwotnych hepatocytów.
P ： Czy stężenie mikrosomów badane w teście stabilności metabolicznej? Jaki jest efekt zbyt wysokiego lub zbyt niskiego?
A ： W teście stabilności metabolicznej stężenie białka wpłynie również na szybkość metaboliczną, zwykle wybierze stężenie białka mikrosomalnego 0,1 mg/ml ~ 1 mg/ml, specyficzny wybór stężenia białka należy wybrać zgodnie z własnymi właściwościami metabolicznymi. Zbyt wysokie stężenie białka mikrosomalnego doprowadzi do nie -specyficznego wiązania leku z białkiem mikrosomalnym; Podczas gdy zbyt niskie stężenie białka mikrosomalnego może prowadzić do nieistotnego metabolizmu leku.