P: Como devo escolher microssomas e hepatócitos para estudos de estabilidade metabólica? Posso escolher apenas um deles para atender ao requisito?
R: No estudo de estabilidade metabólica, a escolha de microssomas hepáticos ou hepatócitos depende principalmente das propriedades metabólicas dos compostos, em que aquele com uma alta taxa metabólica é escolhida. Em geral, os microssomas hepáticos são preferidos, especialmente quando as moléculas compostas são mais água - solúvel e um - metabolismo da fase é a principal via metabólica (especialmente via CYP). Os hepatócitos podem ser usados para experimentos quando há evidências de duas - metabolismo da fase como a principal via, hidrólise como a principal via metabólica, alta ligação de proteínas inespecíficas nos microssomas hepáticos e o metabolismo nos microssomas hepáticos não é evidente. Geralmente, um sistema metabólico pode ser escolhido para atender às necessidades; Se as condições em todos os aspectos permitirem, é definitivamente melhor escolher os dois sistemas ao mesmo tempo.
P: Por que é necessário usar hepatócitos primários para ensaio de indução de enzimas?
A: Enzima CYP - O ensaio induzido precisa ir da "transcrição", "Tradução" para "Post - Modificação de proteína translacional" para obter uma proteína enzimática ativa do CYP. Portanto, o sistema de teste deve ser células hepáticas, não microssomas hepáticos ou fígado S9.
P: Por que preciso escolher três hepatócitos primários humanos doadores para o ensaio de indução de enzimas?
R: De acordo com a introdução às diretrizes para interações medicamentosas, pelo menos três doadores devem ser usados e o resultado da indução de cada doador deve ser avaliado separadamente. Além de produzir resultados estatisticamente significativos, a escolha de três doadores para o experimento também é mais importante para avaliar a variação individual. Se o resultado de pelo menos um doador exceder um limite predeterminado, o candidato a medicamentos poderá ser induzível e seguir a avaliação.
P: Por que se concentrar apenas na indução da enzima CYP e não na indução da enzima UGT?
R: O motivo do foco na indução da cipase é que o mecanismo de indução da cipase foi estudado com mais clareza. Em outras palavras, a razão para não exigir o estudo da indução da ugtase é que o mecanismo ainda não está claro; No entanto, isso não significa que a ugtase não será induzida. As diretrizes também afirmam que não existe um sistema de classificação padronizado para indutores ou inibidores de transportadores e enzimas de metabolismo de fase II.
P: Quanto tempo os hepatócitos primários aderentes podem sobreviver após a ressuscitação e quanto tempo os hepatócitos podem ser mantidos sem cultura aderente após a ressuscitação?
R: Os hepatócitos primários pasteurizados são geralmente usados para ensaios de indução de enzimas. Após a recuperação de células, as células são suspensas no meio de espalhamento da placa, ajustadas à concentração apropriada e cultivadas em placas de colágeno - Em seguida, as células podem ser pasteurizadas em 4 a 6 horas. Depois que as células são ligadas à parede, o meio de manutenção é substituído e mantido por 18 h para garantir a restauração máxima do estado celular. Em seguida, o ensaio de indução de enzimas pode ser realizado para detectar atividade metabólica e nível de indução de mRNA. Do ponto de vista de todo o ciclo, os hepatócitos podem ser mantidos por 6 a 7 dias após a adesão à parede. Com o passar do tempo, o estado da adesão à parede celular se deteriora e as células se destacam e suspenderão.
Se os hepatócitos aderentes não forem cultivados, verificamos que eles podem ser mantidos em um bom estado dentro de 4 a 6 horas. Ainda não realizamos a verificação por um período mais longo.
P: Os hepatócitos podem ser usados como suspensão e células aderentes, dependendo dos diferentes meios de cultura usados?
R: A maioria das células de tecidos e órgãos sólidos é murada, mas nem todas as células são muradas quando cultivadas em - vitro. Se as células são paredes - aderentes ou não, depende do estado das próprias células; Ao mesmo tempo, as células aderentes da parede precisam de meio de cultura específico e de algumas substâncias especiais de adesão a células (por exemplo, ramnogelinogênio, laminina, fibronectina, fator de expansão sérica) que podem participar do processo de ligação celular. Em conclusão, as células aderentes podem ser usadas como células de suspensão, mas as células de suspensão não estão necessariamente disponíveis para uso aderente.
P: Quais são as vantagens/desvantagens do uso de hepatócitos de suspensão de paredes aderentes? Quais são os critérios de decisão?
R: Depois que os hepatócitos são isolados, eles podem ser cultivados em suspensão ou na parede aderente. A atividade da enzima do citocromo P450 a partir de hepatócitos primários cultivados em suspensão é mais consistente com a do In - Vivo nos primeiros 4 ~ 6h e depois diminui rapidamente com o prolongamento do tempo. Portanto, os hepatócitos suspensos são geralmente usados para estudo de estabilidade metabólica ou estudo de perfil de metabólitos. Os hepatócitos primários cultivados na parede aderente têm tempo suficiente para se recuperar de danos para manter as características biológicas e a atividade metabólica dos hepatócitos normais. Portanto, eles geralmente são usados para estudos de indução de enzimas, estudos de citotoxicidade de medicamentos, estabilidade metabólica de medicamentos de metabolização lenta ou estudos de inferência de produtos.
Atualmente, não fornecemos serviços de compra on -line da página da web. Os produtos adicionados ao carrinho de compras após o registro e o login são apenas para referência. Se você precisar comprar nossos produtos, deixe suas informações de contato através do canal de contato e entraremos em contato com você a tempo de concluir nossos serviços.
Q ： Como a ligação não - específica de ligação a proteínas afeta os resultados dos testes?
R ： Se o candidato a medicamento se liga não - especificamente às proteínas microssomais, isso resulta em parâmetros cinéticos alterados. À medida que a concentração de proteínas aumenta, o valor de KM aumenta, resultando em uma depuração intrínseca baixa presumida. Além disso, a ligação do candidato a proteínas em microssomos pode resultar em grandes variações nos resultados de diferentes laboratórios e sistemas diferentes.
Q ： A concentração recomendada da proteína microssômica hepática no manual de instrução do kit de estabilidade metabólica de Fase I ou Fase II é de 0,1 mg/ml - 1 mg/ml, isso significa que, ao usar microssomas hepáticos, ainda é necessário diluí -los antes de adicioná -los ao sistema?
UM: Não há necessidade de diluir os microssomas hepáticos primeiro; A concentração de microssomas hepáticos no kit é de 20 mg/ml e a concentração final de microssomas hepáticos no sistema de teste é de 0,1 - 1 mg/ml, o que pode ser adicionado proporcionalmente.
Q ： Qual é a densidade celular recomendada para testes de estabilidade metabólica de hepatócitos primários? O cálculo de liberação é o mesmo que para os microssomas hepáticos?
R: A densidade celular recomendada para o ensaio de estabilidade metabólica primária dos hepatócitos é de 0,5 a 2 × 106 células/ml e cálculos de folga e processamento dos resultados do ensaio de estabilidade metabólica microssômica hepática são consistentes.
Q ： Quais são os principais ingredientes do seu buffer PBS? Ele contém KCl e NACL?
A ： Os principais componentes do nosso buffer PBS são k2HPO4 e KH2PO4, e estão livres de KCl e NACL.
Q ： Qual é o objetivo dos tampões de fosfato? Por que você precisa de fosfato?
R： Os tampões fosfatos são escolhidos com o objetivo de imitar o ambiente fisiológico, e o fosfato é um dos pares tampão mais importantes para manter o ambiente fluido do corpo.
Q ： Qual é a configuração usual para a concentração de receptores enzimáticos - induzida? Existe alguma solução se a solubilidade do sistema a ser testada for ruim?
A ： O ensaio de indução da enzima precisa ser configurado com 3 concentrações diferentes, o nível de concentração precisa cobrir a concentração eficaz de medicamentos para o sangue esperado em humanos, e a maior concentração é escolhida como pelo menos uma ordem de magnitude maior que a concentração efetiva de medicamentos sanguíneos eficaz em humanos. Se a solubilidade na fase aquosa for baixa, um solvente orgânico poderá ser escolhido como solvente, p. DMSO, mas a quantidade de solvente orgânico adicionado ao sistema precisa ser controlado.
Q ： Em estudos de estabilidade metabólica, é necessário usar dois sistemas de teste, microssomas hepáticos e hepatócitos primários, para teste?
R： Os microssomos hepáticos são vesículas de membrana quase esférica - como estruturas como o retículo endoplasmático fragmentado obtidas durante a homogeneização e a centrifugação diferencial de tecidos hepáticos, e contêm CYP450 e alguns enzimas biphásicos, E.G.G.G.G.G.G.G.G.G.G. Os hepatócitos primários (PHCs) são os hepatócitos cultivados imediatamente após o isolamento direto do fígado animal, que basicamente mantêm as funções metabólicas do fígado, especialmente preservando melhor os níveis de enzima consistentes com os in vivo. No estudo de estabilidade metabólica, não há necessidade de considerar o custo e dois sistemas de teste podem ser selecionados para o teste ao mesmo tempo; ou o sistema de teste apropriado pode ser selecionado de acordo com as propriedades metabólicas do composto, e o princípio é o que o sistema possui uma alta taxa metabólica é selecionada. Em geral, os microssomos hepáticos são a melhor escolha quando as moléculas do composto são mais água - solúvel e o metabolismo da fase é a principal via metabólica (especialmente via CYP); Quando o metabolismo de duas fases é a principal via, a hidrólise é a principal via metabólica, a ligação não específica de proteínas nos microssomas do fígado é muito alta e o metabolismo não é óbvio nos microssomas do fígado, o teste pode ser realizado usando hepatócitos primários.
Q ： A concentração de microssomos é examinada no teste de estabilidade metabólica? Qual é o efeito de muito alto ou muito baixo?
A ： No teste de estabilidade metabólica, a concentração de proteína também afetará a taxa metabólica, geralmente escolhe a concentração de proteína microssômica de 0,1 mg/ml ~ 1 mg/ml, a escolha específica de quanto concentração de proteína deve ser selecionada de acordo com as próprias propriedades metabólicas do composto. Uma concentração muito alta de proteína microssomal levará à ligação não específica do medicamento à proteína microssomal; Embora uma concentração muito baixa de proteína microssômica pode levar ao metabolismo insignificante do medicamento.