В: Как выбрать микросомы и гепатоциты для исследований метаболической стабильности? Могу ли я выбрать только один из них для выполнения требования?
A: В исследовании метаболической стабильности выбор микросомов печени или гепатоцитов в основном зависит от метаболических свойств соединений, где выбирается тот, у кого высокая скорость метаболизма. В общем, микросомы печени являются предпочтительными, особенно когда молекулы соединения являются более водой - растворимым, а один фазовый метаболизм является основным метаболическим путем (особенно через CYP). Гепатоциты могут использоваться для экспериментов, когда имеются свидетельства двух фазового метаболизма в качестве основного пути, гидролиза как основного метаболического пути, высокого неспецифического связывания белка в микросомах печени и метаболизм в микросомах печени не очевиден. Обычно одна метаболическая система может быть выбрана для удовлетворения потребностей; Если условия во всех аспектах позволяют, определенно лучше выбрать обе системы одновременно.
В: Почему необходимо использовать первичные гепатоциты для анализа индукции ферментов?
A: CYP -фермент - Индуцированный анализ должен перейти от «транскрипции», «трансляции» к «после - трансляционная модификация белка» для получения активного ферментного белка CYP. Следовательно, тестовой системой должна быть клетки печени, а не микросомы печени или печень S9.
В: Почему мне нужно выбрать три донорских первичных гепатоцита для анализа индукции фермента?
A: Согласно введению в руководящие принципы для взаимодействия с наркотиками, следует использовать не менее трех доноров, и результат индукции каждого донора следует оценивать отдельно. В дополнение к получению статистически значимых результатов, выбор трех доноров для эксперимента также более важен для оценки межоценков. Если результат по крайней мере одного донора превышает заранее определенного порога, кандидат на лекарство может быть индуцируемым, и требуется оценка UP.
В: Зачем сосредоточиться только на индукции фермента CYP, а не на индукции фермента UGT?
О: Причина сосредоточения внимания на индукции CYPASE заключается в том, что механизм индукции CYPASE был изучен более четко. Другими словами, причина не требует изучения индукции Ugtase, заключается в том, что механизм до сих пор неясен; Однако это не означает, что Ugtase не будет вызвана. В руководящих принципах также указывается, что не существует стандартизированной системы классификации для индукторов или ингибиторов транспортеров и ферментов метаболизма фазы II.
В: Как долго могут выжить приклеенные первичные гепатоциты после реанимации, и как долго можно поддерживать гепатоциты без приверженной культуры после реанимации?
A: Пастеризованные первичные гепатоциты обычно используются для анализа индукции ферментов. После восстановления клеток клетки суспендируют в среде распределения пластины, регулируют к соответствующей концентрации и культивируют в коллагеновых пластинах с покрытием; Тогда ячейки могут быть пастеризованы в течение 4 ~ 6 часов. После того, как клетки прикрепляются к стенке, поддерживающая среда заменяется и поддерживается на 18 ч для обеспечения максимального восстановления состояния ячейки. Затем может быть проведен анализ индукции ферментов для обнаружения метаболической активности и уровня индукции мРНК. С точки зрения всего цикла гепатоциты можно поддерживать в течение 6 ~ 7 дней после соблюдения стен. Со временем состояние адгезии клеточной стенки ухудшается, и клетки будут отсоединять и подвешивать.
Если адгезивные гепатоциты не культивируются, мы подтвердили, что их можно сохранить в хорошем состоянии в течение 4 ~ 6 часов. Мы еще не провели проверку в течение более длительного периода.
В: Гепатоциты могут использоваться в качестве суспензии и прилипших клеток в зависимости от различных используемых культуральных сред?
A: Большинство клеток из твердых тканей и органов обтянуты стеной, но не все клетки обтягиваются на стенке, когда культивируются в - vitro. Являются ли ячейки стенки - приверженца или нет, зависит от состояния самих клеток; В то же время стена - Приглушенные клетки нуждаются в специфической культуральной среде и некоторых специальных веществах адгезии клеток (например, рамногелиноген, ламинин, фибронектин, фактор расширения сыворотки), которые могут участвовать в процессе прикрепления клеток. В заключение, адгезивные ячейки могут использоваться в качестве клеток суспензии, но ячейки суспензии не обязательно доступны для прилипшего использования.
В: Каковы преимущества/недостатки использования прилипающих стихов стен, подвесные гепатоциты? Каковы критерии решения?
A: После того, как гепатоциты изолированы, они могут культивироваться в подвеске или в прилипшей стене. Активность фермента цитохрома P450 из суспензии, культивируемых первичных гепатоцитов, наиболее согласуется с активностью in - vivo в течение первых 4 ~ 6 часов, а затем быстро уменьшается с продлением времени. Следовательно, гепатоциты подвески обычно используются для исследования метаболической стабильности или исследования профилирования метаболита. Первичные гепатоциты, культивируемые в адгезивных стенках, имеют достаточное время для восстановления от повреждения, чтобы поддерживать биологические характеристики и метаболическую активность нормальных гепатоцитов. Следовательно, они обычно используются для индукционных исследований ферментов, исследований цитотоксичности лекарств, метаболической стабильности медленных метаболизирующих лекарств или исследований вывода продукта.
В настоящее время мы не предоставляем услугу покупки веб -страницы. Продукты, добавленные в корзину после регистрации и входа в систему, предназначены только для справки. Если вам нужно купить наши продукты, пожалуйста, оставьте свою контактную информацию через канал Contact Us, и мы свяжемся с вами вовремя, чтобы заполнить наши услуги.
Q: Как не - специфическое связывание белка влияет на результаты теста?
A: Если кандидат на лекарство связывает не - конкретно с микросомальными белками, это приводит к измененным кинетическим параметрам. По мере увеличения концентрации белка значение KM увеличивается, что приводит к низкому предполагаемому внутреннему клиренсу. Кроме того, связывание лекарственного средства с белками в микросомах может привести к большим изменениям в результатах различных лабораторий и различных систем.
Q: Рекомендуемая концентрация микросомального белка печени в руководстве по инструкции по набору метаболической стабильности фазы I или фазы II составляет 0,1 мг/мл - 1 мг/мл, означает ли это, что при использовании микросомов печени все еще необходимо разбавить их, прежде чем добавить их в систему?
A: Нет необходимости сначала разбавлять микросомы печени; Концентрация печеночных микросомов в комплекте составляет 20 мг/мл, а конечная концентрация печеночных микросом в тестовой системе составляет 0,1 мг/мл, что может быть добавлено пропорционально.
Q: Какова рекомендуемая плотность клеток для тестирования метаболической стабильности первичных гепатоцитов? Расчет клиренса таким же, как и для микросомов печени?
A: Рекомендуемая плотность клеток для первичного анализа метаболической стабильности гепатоцитов составляет от 0,5 до 2 × 106 Клетки/мл, и расчеты клиренса и обработка результатов анализа микросомальной метаболической стабильности печени.
Q: Каковы основные ингредиенты в вашем буфере PBS? Он содержит KCL и NaCl?
A ： Основные компоненты нашего буфера PBS - K2HPO4 и кх2PO4и свободны от KCL и NaCl.
Q: Какова цель фосфатных буферов? Зачем вам фосфат?
A: фосфатные буферы выбираются с целью их имитации физиологической среды, а фосфат является одной из наиболее важных пар буферных пар для поддержания жидкой среды организма.
Q: Какова обычная настройка для фермента - Индуцированная концентрация рецепторов? Существует ли какое -либо решение, если растворимость системы, которая должна быть протестирована, плохая?
A ： Анализ индукции фермента должен быть организован с 3 различными концентрациями, уровень концентрации должен покрывать ожидаемую эффективную концентрацию препарата в крови у людей, а самая высокая концентрация выбран как минимум на один порядок выше, чем средняя эффективная концентрация в крови у людей. Если растворимость в водной фазе плохая, в качестве растворителя можно выбрать органический растворитель, например, его растворитель, например, ДМСО, но количество органического растворителя, добавленного в систему, необходимо контролировать.
Q: В исследованиях метаболической стабильности необходимо ли использовать две тестовые системы, микросомы печени и первичные гепатоциты для тестирования?
A ： Микросомы печени являются почти сферической мембранной пузырькой - подобными структурам, образованным в результате самостоятельного слияния фрагментированного эндоплазматического ретикулума, полученного во время гомогенизации и дифференциальной центрифугирования тканей печени, и содержат ферменты CYP450 и некоторые бифазные энзименты, например, STS. Первичные гепатоциты (PHC) - это гепатоциты, культивируемые сразу после прямой изоляции от печени животных, которые в основном поддерживают метаболические функции печени, особенно лучше сохранение уровней фермента, соответствующих уровням in vivo. В исследовании метаболической стабильности нет необходимости учитывать стоимость, и две тестовые системы могут быть выбраны для теста одновременно; Или соответствующая тестовая система может быть выбрана в соответствии с метаболическими свойствами соединения, и принцип - то, что система имеет высокую скорость метаболизма. В целом, микросомы печени являются лучшим выбором, когда молекулы соединения являются более водой - Растворим, а один фазовый метаболизм является основным метаболическим путем (особенно через CYP); Когда два - Фазовый метаболизм является основным путем, гидролиз является основным метаболическим путем, не - специфическое связывание белка в микросомах печени очень высокое, а метаболизм не очевиден в микросомах печени, тест может проводиться с использованием первичных гепатоцитов.
Q: изучается ли концентрация микросомов в тесте на метаболическую стабильность? Каков эффект слишком высокого или слишком низкого?
A: В тесте на метаболическую стабильность концентрация белка также будет влиять на скорость метаболизма, обычно выбирая концентрацию микросомального белка 0,1 мг/мл ~ 1 мг/мл, удельный выбор концентрации белка следует выбрать в соответствии с собственными метаболическими свойствами. Слишком высокая концентрация микросомального белка приведет к не -специфическому связыванию препарата с микросомальным белком; В то время как слишком низкая концентрация микросомального белка может привести к незначительному метаболизму препарата.