Otázka: Ako by som si mal zvoliť mikrozómy a hepatocyty pre štúdie metabolickej stability? Môžem zvoliť iba jedného z nich, aby som splnil požiadavku?
Odpoveď: V štúdii metabolickej stability závisí výber pečeňových mikrozómov alebo hepatocytov hlavne od metabolických vlastností zlúčenín, v ktorých sa vyberie ten s vysokou rýchlosťou metabolizmu. Všeobecne sú preferované pečeňové mikrozómy, najmä ak sú zlúčenina molekuly rozpustnejšie a jeden metabolizmus fázy je hlavnou metabolickou dráhou (najmä prostredníctvom CYP). Hepatocyty sa môžu použiť na experimenty, keď existujú dôkazy o dvoch fázových metabolizme ako hlavnej dráhe, hydrolýze ako hlavnej metabolickej dráhy, vysokej nešpecifickej väzbe proteínov v pečeňových mikrozómoch a metabolizmus v pečeňových mikrozómoch nie je zrejmý. Zvyčajne je možné zvoliť jeden metabolický systém, ktorý vyhovuje potrebám; Ak podmienky vo všetkých aspektoch umožňujú, je určite najlepšie zvoliť oba systémy súčasne.
Otázka: Prečo je potrebné použiť primárne hepatocyty na test indukcie enzýmov?
Odpoveď: Enzým CYP - indukovaný test musí prejsť z „transkripcie“, „translácie“ na „Post - Translačnú modifikáciu proteínu“, aby sa získal aktívny proteín enzýmu CYP. Preto by skúšobným systémom mali byť pečeňové bunky, nie pečeňové mikrozómy alebo pečeň S9.
Otázka: Prečo si potrebujem zvoliť tri primárne hepatocyty darcu pre test enzýmu indukčný test?
Odpoveď: Podľa úvodu k usmerneniam pre liekové interakcie by sa mali použiť najmenej traja darcovia a indukčný výsledok každého darcu by sa mal hodnotiť osobitne. Okrem dosiahnutia štatisticky významných výsledkov je výber troch darcov pre experiment dôležitejší aj pri hodnotení inter - individuálnych variácií. Ak výsledok najmenej jedného darcu presahuje vopred určený prah, kandidát na liek môže byť indukovateľný a vyžaduje sa hodnotenie - UP.
Otázka: Prečo sa zameriavať iba na indukciu enzýmu CYP a nie na indukciu enzýmu UGT?
Odpoveď: Dôvodom zamerania na indukciu cypázy je to, že mechanizmus indukcie cypázy sa študoval jasnejšie. Inými slovami, dôvodom, prečo nevyžadujú štúdium indukcie ugtázy, je to, že mechanizmus je stále nejasný; To však neznamená, že Ugtas nebude indukovaná. Pokyny tiež uvádzajú, že neexistuje štandardizovaný klasifikačný systém pre induktory alebo inhibítory transportérov a enzýmov metabolizmu fázy II.
Otázka: Ako dlho môžu adherentné primárne hepatocyty prežiť po resuscitácii a ako dlho môžu byť hepatocyty udržiavané bez adherentnej kultúry po resuscitácii?
A: Pasterizované primárne hepatocyty sa všeobecne používajú na testy indukcie enzýmov. Po regenerácii buniek sú bunky suspendované v médiu šírenia dosiek, upravené na primeranú koncentráciu a kultivujú sa na doskách potiahnutých kolagénom; Potom môžu byť bunky pasterizované do 4 až 6 hodín. Po pripojení buniek k stene je údržbárske médium vymenené a udržiavané 18 hodín, aby sa zabezpečilo maximálne obnovenie bunkového stavu. Ďalej sa môže vykonať test indukcie enzýmov na detekciu metabolickej aktivity a úrovne indukcie mRNA. Z hľadiska celého cyklu sa hepatocyty môžu udržiavať 6 až 7 dní po dodržiavaní steny. Postupom času sa zhoršuje stav adherencie bunkovej steny a bunky sa oddeľujú a suspendujú.
Ak sa adherentné hepatocyty nekultivujú, overili sme, že sa dajú udržiavať v dobrom stave do 4 až 6 hodín. Zatiaľ sme vykonávali overenie na dlhšie obdobie.
Otázka: Hepatocyty sa môžu použiť ako suspenzia aj adherentné bunky v závislosti od rôznych použitých kultivačných médií?
Odpoveď: Väčšina buniek z tuhých tkanív a orgánov je murovaná, ale nie všetky bunky sú pri kultivovaných v vitro murované. Či sú bunky adherentné alebo nie, závisí od stavu samotných buniek; Zároveň potrebujú stenu - adherentné bunky špecifické kultivačné médium a niektoré špeciálne pro - bunkové adhézne látky (napr. Rhamnogelinogén, laminín, fibronektín, expanzný faktor v sére), ktoré sa môžu zúčastňovať na procese viazania buniek. Záverom možno povedať, že adherentné bunky sa môžu použiť ako suspenzné bunky, ale bunky suspenzie nie sú nevyhnutne dostupné na adherentné použitie.
Otázka: Aké sú výhody/nevýhody používania adherentných hepatocytov zavesenia na stenu? Aké sú kritériá rozhodovania?
Odpoveď: Po izolovaní hepatocytov sa môžu kultivovať v suspenzii alebo v adherentnej stene. Aktivita enzýmu cytochrómu P450 zo suspenzie kultivovaných primárnych hepatocytov je najviac konzistentná s aktivitou v - Vivo počas prvých 4 ~ 6 hodín, potom rýchlo klesá s predĺžením času. Preto sa hepatocyty suspenzie všeobecne používajú na štúdiu metabolickej stability alebo na štúdiu profilovania metabolitov. Primárne hepatocyty kultivované v adherentnej stene majú dostatok času na to, aby sa zotavili z poškodenia, aby sa udržali biologické charakteristiky a metabolickú aktivitu normálnych hepatocytov. Preto sa všeobecne používajú na štúdie indukcie enzýmov, štúdie cytotoxicity liečiva, metabolickú stabilitu pomalých metabolizujúcich liekov alebo štúdie inferencie produktov.
V súčasnosti neposkytujeme službu nákupu webovej stránky online. Výrobky pridané do nákupného košíka po registrácii a prihlásení sú iba na referenciu. Ak potrebujete kúpiť naše produkty, nechajte svoje kontaktné informácie prostredníctvom kanála Kontaktujte USA a my vás budeme kontaktovať včas, aby ste dokončili naše služby.
Otázka ： Ako ovplyvňuje ne - Viazanie proteínu výsledky testov?
A ： Ak sa kandidát na liek viaže ne - špecificky na mikrozomálne proteíny, má to za následok zmenené kinetické parametre. Keď sa koncentrácia proteínu zvyšuje, hodnota KM sa zvyšuje, čo vedie k nízkej predpokladanej vnútornej klírensu. Väzba kandidáta na liek na proteíny v mikrozómoch môže tiež viesť k veľkým variáciám vo výsledkoch z rôznych laboratórií a rôznych systémov.
Q ： Odporúčaná koncentrácia mikrozomálneho proteínu pečene v návode na súpravu metabolickej stability fázy I alebo fázy II je 0,1 mg/ml - 1 mg/ml, znamená to, že pri používaní mikrozómov pečene je stále potrebné ich pred pridaním do systému dobre zriediť?
A: Nie je potrebné najprv zriediť pečeňové mikrozómy; Koncentrácia pečeňových mikrozómov v súprave je 20 mg/ml a konečná koncentrácia pečeňových mikrozómov v testovacom systéme je 0,1 - 1 mg/ml, čo je možné pridať úmerne.
Otázka ： Aká je odporúčaná hustota buniek na testovanie metabolických stability primárnych hepatocytov? Je výpočet klírens rovnaký ako pre pečeňové mikrozómy?
A ： Odporúčaná hustota buniek pre primárny test metabolickej stability hepatocytov je 0,5 až 2 × 106 Bunky/ml a výpočty klírensu a spracovanie výsledkov testu metabolickej stability metabolickej stability v pečeni sú konzistentné.
Otázka ： Aké sú hlavné prísady vo vašom pufri PBS? Obsahuje KCL a NaCl?
A ： Hlavné komponenty našej vyrovnávacej pamäte PBS sú K2HPO4 a kh2PO4a sú bez KCL a NaCl.
Otázka ： Aký je účel fosfátových pufrov? Prečo potrebujete fosfát?
A na účely napodobňovania fyziologického prostredia sa vyberajú tlmivé roztoky fosfátov a fosfát je jedným z najdôležitejších pufrových párov na udržanie tekutého prostredia tela.
Otázka ： Aké je obvyklé nastavenie koncentrácie receptora indukovaného enzýmom? Existuje nejaké riešenie, ak je rozpustnosť systému, ktorý sa má testovať, slabá?
A ： Test indukcie enzýmov musí byť nastavený s 3 rôznymi koncentráciami, úroveň koncentrácie musí pokryť očakávanú účinnú koncentráciu liečiva v krvi u ľudí a najvyššia koncentrácia je zvolená tak, aby bola najmenej o jeden rád vyššia ako priemerná účinná koncentrácia liečiva krvi u ľudí. Ak je rozpustnosť vo vodnej fáze zlá, môže byť zvolená organické rozpúšťadlo ako jeho rozpúšťadlo, napr. DMSO, ale množstvo organického rozpúšťadla pridaného do systému je potrebné kontrolovať.
Q ： V štúdiách metabolickej stability je potrebné na testovanie použiť dva testovacie systémy, mikrozómy pečene a primárne hepatocyty?
： Pečeňové mikrozómy sú takmer sférické membránové vezikuly podobné štruktúram tvoreným vlastným fúziou fragmentovaných endoplazmatických retikula získaných počas homogenizácie a diferenciálnej centrifugácie pečeňových tkanív a obsahuje enzýmy CYP450 a obsahujú CYP450 enzýmy a obsahuje E.G., UGT, UGTS. Primárne hepatocyty (PHCS) sú hepatocyty kultivované bezprostredne po priamej izolácii od živočíšnych pečene, ktoré v podstate udržiavajú metabolické funkcie pečene, najmä lepšie zachovanie hladín enzýmu v súlade s tými in vivo. V štúdii metabolickej stability nie je potrebné brať do úvahy náklady a súčasne môžu byť zvolené dva testovacie systémy; alebo príslušný testovací systém je možné vybrať podľa metabolických vlastností zlúčeniny a princípom je, že systém má vysokú rýchlosť metabolizmu. Všeobecne sú pečeňové mikrozómy najlepšou voľbou, keď sú zlúčeniny molekúl viac rozpustné a jeden metabolizmus fázy je hlavnou metabolickou dráhou (najmä prostredníctvom CYP); Keď je hlavnou cestou dva - fázové metabolizmus, hydrolýza je hlavnou metabolickou dráhou, ne - špecifická väzba proteínu v pečeňových mikrozómoch je veľmi vysoká a metabolizmus nie je zrejmý v pečeňových mikrozómoch, test sa môže vykonať pomocou primárnych hepatocytov.
Otázka ： Je koncentrácia mikrozómov skúmaná v teste metabolickej stability? Aký je účinok príliš vysokého alebo príliš nízkeho?
A ： Pri teste metabolickej stability bude koncentrácia proteínu tiež ovplyvniť rýchlosť metabolizmu, zvyčajne si vyberie koncentráciu mikrozomálneho proteínu 0,1 mg/ml ~ 1 mg/ml, čo je špecifická voľba koncentrácie proteínu podľa vlastných metabolických vlastností zlúčeniny. Príliš vysoká koncentrácia mikrozomálneho proteínu povedie k ne - špecifickej väzbe liečiva na mikrozomálny proteín; Aj keď príliš nízka koncentrácia mikrozomálneho proteínu môže viesť k zanedbateľným metabolizmom liečiva.