Inducirani delež jeter podgan S9: presnovni aktivacijski sistem za in vitro teste genotoksičnosti in mutacije

Ključne besede: OECD 471, OECD 473, OECD 476, OECD 487, Mutacijski test, genotoksičnost, genetska strupenost, inducirana jetrna podgana S9, Ames test, Mini Ames test, kromosomska aberacija, mikronukleus, HPRT/HGPRT, TK Assay

IPHASE izdelek

Uvod

Inducirana jetra podgana S9je ključna sestavina pri ocenjevanjugenetska strupenostpotencial kemikalij, zlasti v regulativni toksikologiji. Običajno se uporablja v kombinaciji z in vitro testi, kot soAmes test inMutacijski testi, za oceno mutagenih lastnosti spojin. Z zagotavljanjem encimskega sistema, bogatega s citokromom P450 (CYP450), ima inducirana frakcija jeter podgan S9 ključno vlogo pri simuliranju presnovnih procesov, ki se pojavijo v jetrih, kar pomaga ugotoviti, ali lahko kemikalije potencialno povzročijo genetske mutacije ali raka.

Inducirana jetra podgana S9

Frakcija jeter S9 se nanaša na post - mitohondrijski supernatant, pridobljen iz homogenatov jeter podgan po nizu korakov centrifugiranja. Izraz "induciran" se nanaša na zdravljenje podgan s specifičnimi spojinami, ki povečujejo aktivnost jetrnih encimov, zlasti encimov citokroma P450 (CYP450), ki so odgovorni za presnovo širokega območja ksenobiotika.

Inducirani delež jeter podgan S9 vsebuje različne encime, ki sodelujejo v presnovi kemikalij faze I in faze II. To vključuje encime, kot so citokrom p450 monooksigenaze, ki olajšajo oksidativno biotransformacijo substratov in s tem posnemajo presnovo človeških jeter.

Aktivnost CYP450 in presnovna aktivacija

Družina encimov citokroma P450 (CYP450) ima ključno vlogo pri presnovi najrazličnejših snovi, vključno s številnimi farmacevtskimi izdelki, okoljskimi kemikalijami in rakotvornimi snovi. Inducirani delež jeter podgan S9 vsebuje te encime in je bistvenega pomena za ocenjevanje kemikalij, ki lahko postanejo genotoksični šele po presnovni aktivaciji.

Številne spojine so sprva ne - strupene, vendar lahko postanejo strupene po presnovi v jetrih. Te pro - mutagene (ki zahtevajo presnovno aktivacijo, da postanejo mutageni), pro - rakotvornice (ki potrebujejo aktivacijo za povzročitev raka) je mogoče zaznati le s testi, ki vključujejo S9 presnovni aktivacijski sistem. Brez indukcije presnovnih encimov, kot je CYP450, se lahko zdi, da so te snovi neškodljive pri standardnih testih genotoksičnosti.

Z dodajanjem induciranih jeter podgan S9 v teste in vitro lahko raziskovalci ocenijo, kako snov vpliva na encime CYP450. To je še posebej pomembno za farmacevtske izdelke, saj je metabolizem encimov CYP450 kritičen korak v farmakokinetiki številnih zdravil.

Uporaba induciranih jeter podgan S9

1. 1. Ames test (OECD 471)

Ames test, opisan v smerniciOECD 471, je ena najbolj dobro znanih in široko uporabljenih metod za oceno mutagenosti. Vključuje izpostavljanje sevov bakterij salmonele testni kemikaliji, da ugotovi, ali to povzroči mutacije, zaradi katerih se bakterije vrnejo v histidin - neodvisno stanje.

Za simulacijo človeškega presnovnega procesa se v preskusni sistem pogosto doda inducirana jetra podgana S9. Frakcija S9 zagotavlja potrebne encime, vključno s CYP450, ki je morda potrebna za presnovo spojine v bolj reaktivno obliko, ki bi lahko povzročila mutacije v bakterijski DNK. Ta kombinacija S9 s testom AMES omogoča bolj celovito oceno mutagenega potenciala z posnemanjem neposrednih in presnovno aktiviranih mutagenih mehanizmov.

2. 2.Mutacijski testi (kromosomski aberacijski test, mikronukleus test in drugi testi in vitro)

Poleg testa AMES se za oceno genotoksičnega potenciala kemikalij običajno uporabljajo tudi testi mutacije. Ti testi so bolj obsežni pri ocenjevanju številnih genetskih poškodb, vključno s kromosomskimi mutacijami, genskimi mutacijami in tvorbo mikronuklei. Inducirana jetra podgana S9 se uporablja pri preskusih mutacije iz naslednjih razlogov:

Mikronukleus test (OECD 487)

Ta test zazna tvorbo mikronuklei v celicah, ki so majhna, ekstranuklearna telesa, ki vsebujejo fragmente kromosomov ali celih kromosomov, ki niso bili vgrajeni v jedro med celično delitvijo. The mikronukleus testlahko odkrije učinke klastogenih (kromosoma - lomljenja) in aneugenih (vpliva na število kromosomov). Inducirana jetra podgana S9 se tukaj uporablja za prekrivanje preskusne snovi, saj nekatere kemikalije povzročajo kromosomsko poškodbo le, ko jih presnavljajo jetrni encimi. Frakcija S9 poveča občutljivost testa s simulacijo presnovne aktivacije, ki se lahko pojavi in ​​vivo.

Test kromosomske aberacije (OECD 473)

Ta test ocenjuje, ali lahko snov povzroči strukturno poškodbo kromosomov z indukcijo prekinitev, delecij, translokacij ali drugih vrst aberacij. Kot mikronukleus test,Kromosomski test aberacijelahko uporabimo z ali brez presnovne aktivacije. Inducirani jetri podgane S9 se dodajo preskusnemu sistemu, da posnemajo presnovne procese v jetrih, kar omogoča oceno snovi, ki v prvotni obliki ne bi smeli povzročiti kromosomske poškodbe, vendar bi to lahko storili po presnovi jeter.

Tabela 1. Primerjalni vidiki mutacijskih testov

HPRT/HGPRT test (OECD 476)

VHPRT/HGPRT test, Kulture kitajskega hrčka (CHO ali V79) ali človeških limfoblastoidnih celic (TK6) so izpostavljene preskusni kemikaliji v prisotnosti inducirane presnovne mešanice jeter podgane S9, ki oskrbuje encime CYP450, potrebne za pretvorbo pro -mutagenov v DNK -reaktivne vrste. Po kratkem zdravljenju in sedemdnevnem obdobju ekspresije celice izzivajo s 6 -tioguaninom; Samo kloni, ki imajo mutacije izgube funkcije v hipoksantin -guaninskem genu fosforibosiltransferaze. S primerjanjem števila mutiranih kolonij s splošno sposobnostjo preživetja raziskovalci določajo frekvenco mutacije, ki, če so ponovljivo povišana tako po sočasnih kot zgodovinskih kontrolah, kaže na genotoksični potencial.

TK teste (OECD 490 & OECD 476)

TheTK test Uporablja bodisi L5178Y mišične limfomske celice (OECD 490) ali CHO celice (OECD 476) izdelano heterorozno na lokusu timidin kinaze. Po kemični izpostavljenosti ± S9 mešanice celice opomorejo in se prevlečejo v medij, ki vsebuje trifluorotimidin, ki ubija celice, ki niso sposobne TK. Preživeli tk⁻ mutanti tvorijo kolonije v 10–14 dneh, mali kolonični mutanti pa pogosto odražajo kromosomske dogodke in mutante z velikimi koloniji, ki odražajo točkovne mutacije. Tako kot v testu HPRT/HGPRT tudi stroge citotoksičnost in pozitivna merila mutagena zagotavljata, da opažena povečanja frekvence mutacije zanesljivo odražajo genotoksično tveganje spojine.

4. 4. Ocena tveganja za raka

Inducirana podgana jetra S9 se uporablja tudi v študijah, katerih namen je ocenjevanje raka - povzroči potencial snovi. S simulacijo presnovnih procesov, ki se pojavljajo v človeških jetrih, lahko frakcija S9 pomaga prepoznati spojine, ki lahko privedejo do nastanka reaktivnih presnovkov, ki se lahko vežejo na DNK, in povzročijo mutacije, ki bi lahko privedle do raka.

Izboljšan Ames test z induciranim hrčkom jeter S9

V skladu z najnovejšimi smernicami, ki jih je izdala Evropska agencija za zdravila (EMA), tradicionalni test AMES morda ni dovolj občutljiv, da bi odkril mutageni potencial nekaterih n - nitrozaminskih nečistoč, zlasti n - nitrosodimetilamina (NDMA), med drugim. Zato je bil priporočljiv izboljšani AMES test, ki ga je razvil Nacionalni center za toksikološke raziskave (NCTR), delitev ameriške uprave za hrano in zdravila (FDA), kot zanesljivejša alternativa. Izboljšani AMES test je uvedel dodajanje induciranih hrčk jeter S9, ki je izvedel 30% podgane jeter S9 in 30% hrčka jeter S9. Desmosomske supernatante podgane in hrčka (S9) je treba pripraviti iz jeter glodalcev, obdelanih s citokrom P450 encim - snovi, ki povzročajo snovi. Z uporabo induciranega hrčka jeter S9 ta izboljšan test bolje simulira presnovo človeka in poveča zanesljivost rezultatov.

Zaključek

Inducirana jetra podgana S9 služi kot kritično orodje pri testiranju genotoksičnosti, ki pomaga raziskovalcem in regulativnim agencijam oceniti mutageni in rakotvorni potencial kemikalij. Z zagotavljanjem presnovnega aktivacijskega sistema izboljšuje sposobnost testov, kot so Ames test, testi za mutacije in študije aktivnosti CYP450, da odkrijejo snovi, za katere je potrebna presnovna aktivacija, da postanejo genotoksična. Njegove aplikacije so bistvene za zagotavljanje varnosti novih zdravil, kemikalij in potrošniških izdelkov. S svojo vlogo pri simuliranju presnove jeter človeških jeter je inducirana frakcija jeter podgan S9 še naprej nepogrešljiv del sodobne ocene toksikologije in regulativne varnosti.