Pyetje: Si duhet të zgjedh mikrosomet dhe hepatocitet për studime të stabilitetit metabolik? A mund të zgjedh vetëm një prej tyre për të përmbushur kërkesën?
Përgjigje: Në studimin e stabilitetit metabolik, zgjedhja e mikrosomave të mëlçisë ose hepatociteve kryesisht varet nga vetitë metabolike të komponimeve, ku zgjidhet ajo me një normë të lartë metabolike. Në përgjithësi, mikrosomat e mëlçisë preferohen, veçanërisht kur molekulat e përbërjes janë më shumë ujë - i tretshëm dhe një - metabolizmi fazor është rruga kryesore metabolike (veçanërisht përmes CYP). Hepatocitet mund të përdoren për eksperimente kur ka prova të dy - metabolizmit të fazës si rrugë kryesore, hidroliza si rruga kryesore metabolike, lidhja e proteinave të larta jospecifike në mikrosomet e mëlçisë dhe metabolizmi në mikrosomet e mëlçisë nuk është e dukshme. Zakonisht, një sistem metabolik mund të zgjidhet për të përmbushur nevojat; Nëse kushtet në të gjitha aspektet lejojnë, është padyshim më mirë të zgjidhni të dy sistemet në të njëjtën kohë.
Pyetje: Pse është e nevojshme të përdorni hepatocitet parësore për analizën e induksionit të enzimës?
A: Enzima CYP - Vlerësimi i induktuar duhet të shkojë nga "transkriptimi", "përkthimi" në "post - Modifikimi i përkthimit të proteinës" për të marrë një proteinë aktive të enzimës CYP. Prandaj, sistemi i provës duhet të jetë qelizat e mëlçisë, jo mikrosomat e mëlçisë ose mëlçia S9.
Pyetje: Pse më duhet të zgjedh tre hepatocitet parësore njerëzore të donatorëve për analizën e induksionit të enzimës?
Përgjigje: Sipas prezantimit të udhëzimeve për ndërveprimet e drogës, duhet të përdoren të paktën tre donatorë, dhe rezultati i induksionit të secilit donator duhet të vlerësohet veçmas. Përveç prodhimit të rezultateve statistikisht të rëndësishme, zgjedhja e tre donatorëve për eksperimentin është gjithashtu më e rëndësishme për vlerësimin e ndryshimeve ndër - individuale. Nëse rezultati nga të paktën një donator tejkalon një prag të paracaktuar, kandidati i drogës mund të jetë i induktueshëm dhe kërkohet vlerësim i ndjekjes -
Pyetje: Pse të përqendrohemi vetëm në induksionin e enzimës CYP dhe jo në induksionin e enzimës UGT?
Përgjigje: Arsyeja për t'u përqëndruar në induksionin e Cypase është se mekanizmi i induksionit të Cypase është studiuar më qartë. Me fjalë të tjera, arsyeja për të mos kërkuar studimin e induksionit ugtase është se mekanizmi është akoma i paqartë; Sidoqoftë, kjo nuk do të thotë që UGTaza nuk do të nxitet. Udhëzimet gjithashtu shprehen se nuk ka një sistem të standardizuar të klasifikimit për indukuesit ose frenuesit e transportuesve dhe enzimat e metabolizmit të fazës II.
Pyetje: Sa kohë mund të mbijetojnë hepatocitet parësore aderuese pas ringjalljes, dhe sa kohë mund të mbahen hepatocitet pa kulturë aderuese pas ringjalljes?
Përgjigje: Hepatocitet parësore të pasterizuara zakonisht përdoren për analizat e induksionit të enzimës. Pas rikuperimit të qelizave, qelizat pezullohen në mediumin e përhapjes së pllakave, rregullohen në përqendrimin e duhur dhe kulturohen në pllaka të veshura me kolagjen -; atëherë qelizat mund të pasterizohen brenda 4 ~ 6 orë. Pasi qelizat të jenë ngjitur në mur, mediumi i mirëmbajtjes zëvendësohet dhe mirëmbahet për 18 orë për të siguruar restaurimin maksimal të gjendjes së qelizave. Tjetra, analiza e induksionit të enzimës mund të kryhet për të zbuluar aktivitetin metabolik dhe nivelin e induksionit të mRNA. Nga këndvështrimi i të gjithë ciklit, hepatocitet mund të mirëmbahen për 6 ~ 7 ditë pas aderimit të murit. Me kalimin e kohës, gjendja e aderimit të murit qelizor përkeqësohet, dhe qelizat do të shkëputen dhe pezullojnë.
Nëse hepatocitet aderuese nuk janë të kulturuara, ne kemi verifikuar se ato mund të mirëmbahen në një gjendje të mirë brenda 4 ~ 6 orësh. Ne ende nuk kemi kryer verifikimin për një periudhë më të gjatë.
Pyetje: Hepatocitet mund të përdoren si pezullim dhe qeliza aderuese në varësi të mediave të ndryshme të kulturës të përdorura?
Përgjigje: Shumica e qelizave nga indet e ngurta dhe organet janë mure, por jo të gjitha qelizat janë murt kur kulturohen në - vitro. Nëse qelizat janë në mur - aderuese ose jo varet nga vetë gjendja e qelizave; Në të njëjtën kohë, qelizat në mur - ngjitëse kanë nevojë për medium specifik të kulturës dhe disa substanca të veçanta të ngjitjes së qelizave (p.sh., rhamnogelinogen, laminin, fibronectin, faktori i zgjerimit të serumit) të cilat mund të marrin pjesë në procesin e lidhjes së qelizave. Si përfundim, qelizat ngjitëse mund të përdoren si qeliza pezullimi, por qelizat e pezullimit nuk janë domosdoshmërisht të disponueshme për përdorim aderues.
Pyetje: Cilat janë avantazhet/disavantazhet e përdorimit të hepatociteve të pezullimit të vargjeve të murit? Cilat janë kriteret e vendimit?
Përgjigje: Pasi të izolohen hepatocitet, ato mund të kulturohen në pezullim ose në mur aderues. Aktiviteti i enzimës së citokromit P450 nga hepatocitet parësore të kulturuara të pezullimit është më i qëndrueshëm me atë të in - vivo për 4 ~ 6h të parë, pastaj zvogëlohet me shpejtësi me zgjatjen e kohës. Prandaj, hepatocitet e pezullimit zakonisht përdoren për studimin e stabilitetit metabolik ose studimin e profilizimit të metabolitit. Hepatocitet parësore të kulturuara në mur aderues kanë kohë të mjaftueshme për t'u rikuperuar nga dëmtimi për të ruajtur karakteristikat biologjike dhe aktivitetin metabolik të hepatociteve normale. Prandaj, ato zakonisht përdoren për studime të induksionit të enzimës, studime të citotoksicitetit të ilaçeve, stabilitet metabolik të ilaçeve të ngadalta metabolizuese ose studimeve të konkluzionit të produktit.
Aktualisht, ne nuk ofrojmë shërbimin e blerjes në internet të faqes në internet. Produktet e shtuara në karrocën e blerjeve pas regjistrimit dhe hyrjes janë vetëm për referencë. Nëse keni nevojë për të blerë produktet tona, ju lutemi lini informacionin tuaj të kontaktit përmes kanalit na kontaktoni, dhe ne do t'ju kontaktojmë me kohë për të përfunduar shërbimet tona.
Q ： Si ndikon jo - lidhja specifike e proteinave ndikon në rezultatet e provës?
A ： Nëse kandidati i ilaçit lidhet jo - posaçërisht me proteinat mikrosomale, kjo rezulton në parametra kinetikë të ndryshuar. Ndërsa përqendrimi i proteinave rritet, vlera e km rritet, duke rezultuar në një pastrim të ulët të supozuar të brendshëm. Gjithashtu, lidhja e kandidatit për ilaçe me proteina në mikrosome mund të rezultojë në ndryshime të mëdha në rezultate nga laboratorë të ndryshëm dhe sisteme të ndryshme.
Q ： Përqendrimi i rekomanduar i proteinës mikrosomale të mëlçisë në manualin e udhëzimeve të fazës I ose Kit të qëndrueshmërisë metabolike të fazës II është 0,1 mg/ml - 1 mg/ml, a do të thotë kjo se kur përdorni mikrosome të mëlçisë, është akoma e nevojshme t'i holloni ato mirë përpara se t'i shtoni ato në sistem?
A: Nuk ka nevojë për të holluar së pari mikrosomat hepatike; Përqendrimi i mikrosomeve hepatike në komplet është 20 mg/ml dhe përqendrimi përfundimtar i mikrosomave hepatike në sistemin e provës është 0.1 - 1 mg/ml, i cili mund të shtohet në mënyrë proporcionale.
Q ： Cila është dendësia e rekomanduar e qelizave për testimin e stabilitetit metabolik të hepatociteve parësore? A është llogaritja e pastrimit e njëjtë si për mikrosomat e mëlçisë?
A ： Dendësia e rekomanduar e qelizave për analizën parësore të stabilitetit metabolik të hepatociteve është 0.5 deri 2 × 106 Qelizat/ml, dhe llogaritjet e pastrimit dhe përpunimi i rezultateve të analizës së stabilitetit metabolik mikrosomal hepatik janë të qëndrueshme.
Q ： Cilët janë përbërësit kryesorë në tampon tuaj PBS? A përmban KCL dhe NaCl?
A ： Përbërësit kryesorë të tamponit tonë PBS janë k2HPO4 dhe KH2PO4, dhe janë pa KCL dhe NaCl.
Q ： Cili është qëllimi i tamponëve të fosfatit? Pse keni nevojë për fosfat?
Një buffers fosfat janë zgjedhur për qëllimin e tyre për të imituar mjedisin fiziologjik, dhe fosfati është një nga çiftet më të rëndësishme tampon për mirëmbajtjen e mjedisit të lëngut të trupit.
Q ： Cila është vendosja e zakonshme për enzimën - Përqendrimi i receptorit të induktuar? A ka ndonjë zgjidhje nëse tretshmëria e sistemit që do të testohet është e dobët?
Një ： Vlerësimi i induksionit të enzimës duhet të vendoset me 3 përqendrime të ndryshme, niveli i përqendrimit duhet të mbulojë përqendrimin e pritshëm efektiv të ilaçeve në gjak te njerëzit, dhe përqendrimi më i lartë zgjidhet të jetë së paku një rend i madhësisë më i lartë se përqendrimi mesatar efektiv i ilaçeve në gjak në njerëz. Nëse tretshmëria në fazën ujore është e dobët, një tretës organik mund të zgjidhet si tretësi i tij, p.sh. DMSO, por sasia e tretësit organik të shtuar në sistem duhet të kontrollohet.
Q ： Në studimet e stabilitetit metabolik, a është e nevojshme të përdorni dy sisteme provë, mikrosomet e mëlçisë dhe hepatocitet parësore, për testimin?
Një mikrosome hepatike hepatike janë vezikula gati sferike të membranës - si strukturat e formuara nga vetë - bashkimi i retikulës endoplazmatike të fragmentuar të marra gjatë homogjenizimit dhe centrifugimit diferencial të indeve hepatike, dhe përmbajnë enzima CYP450 dhe disa enzima bipazike, p.sh., UGT, Sts. Hepatocitet parësore (PHC) janë hepatocite të kulturuara menjëherë pas izolimit të drejtpërdrejtë nga mëlçia e kafshëve, të cilat në thelb ruajnë funksionet metabolike të mëlçisë, veçanërisht duke ruajtur më mirë nivelet e enzimës në përputhje me ato in vivo. Në studimin e stabilitetit metabolik, nuk ka nevojë të merret parasysh kostoja, dhe dy sisteme provash mund të zgjidhen për testin në të njëjtën kohë; ose sistemi i duhur i provës mund të zgjidhet sipas vetive metabolike të kompleksit, dhe parimi është ai që sistemi ka një normë të lartë metabolike është zgjedhur. Në përgjithësi, mikrosomat e mëlçisë janë zgjidhja më e mirë kur molekulat e përbërjes janë më shumë ujë - i tretshëm dhe një - metabolizmi i fazës është rruga kryesore metabolike (veçanërisht përmes CYP); Kur dy - metabolizmi i fazës është rruga kryesore, hidroliza është rruga kryesore metabolike, jo - lidhja e proteinave specifike në mikrosomet e mëlçisë është shumë e lartë, dhe metabolizmi nuk është i dukshëm në mikrosomat e mëlçisë, testi mund të kryhet duke përdorur hepatocitet parësore.
Q ： A është përqendrimi i mikrosomeve të ekzaminuar në testin e stabilitetit metabolik? Cili është efekti i shumë i lartë apo shumë i ulët?
Një ： Në testin e stabilitetit metabolik, përqendrimi i proteinave gjithashtu do të ndikojë në shkallën metabolike, zakonisht zgjidhni përqendrimin e proteinave mikrosomale prej 0,1 mg/ml ~ 1 mg/ml, zgjedhja specifike se sa përqendrimi i proteinave duhet të zgjidhet sipas vetive të veta metabolike të kompleksit. Përqendrimi shumë i lartë i proteinës mikrosomale do të çojë në lidhje jo - specifike të ilaçit në proteinën mikrosomale; Ndërsa një përqendrim shumë i ulët i proteinës mikrosomale mund të çojë në metabolizëm të parëndësishëm të ilaçit.