F: Hur ska jag välja mikrosomer och hepatocyter för metaboliska stabilitetsstudier? Kan jag bara välja en av dem för att uppfylla kravet?
S: I metabolisk stabilitetsstudie beror valet av levermikrosomer eller hepatocyter främst på de metaboliska egenskaperna hos föreningarna, varvid den med en hög metabolisk hastighet väljs. I allmänhet föredras levermikrosomer, särskilt när de sammansatta molekylerna är mer vatten - lösliga och en - fasmetabolism är den huvudsakliga metaboliska vägen (särskilt via CYP). Hepatocyter kan användas för experiment när det finns bevis på två - fasmetabolism som den huvudsakliga vägen, hydrolys som den huvudsakliga metaboliska vägen, högt ospecifikt proteinbindning i levermikrosomer och metabolism i levermikrosomer är inte uppenbart. Vanligtvis kan ett metaboliskt system väljas för att tillgodose behoven; Om förhållandena i alla aspekter tillåter är det definitivt bäst att välja båda systemen samtidigt.
F: Varför är det nödvändigt att använda primära hepatocyter för enzyminduktionsanalys?
S: CYP -enzym - inducerad analys måste gå från "transkription", "översättning" till "post - translationell modifiering av protein" för att erhålla ett aktivt CYP -enzymprotein. Därför bör testsystemet vara leverceller, inte levermikrosomer eller lever S9.
F: Varför behöver jag välja tre donator humana primära hepatocyter för enzyminduktionsanalysen?
S: Enligt introduktionen till riktlinjerna för läkemedelsinteraktioner bör minst tre givare användas, och induktionsresultatet av varje givare bör utvärderas separat. Förutom att producera statistiskt signifikanta resultat är valet av tre givare för experimentet också viktigare för att bedöma inter - individuell variation. Om resultatet från minst en givare överskrider en förutbestämd tröskel kan läkemedelskandidaten vara inducerbar och följa upp utvärderingen krävs.
F: Varför fokusera bara på CYP -enzyminduktion och inte på UGT -enzyminduktion?
S: Anledningen till att fokusera på cypasinduktion är att mekanismen för cypasinduktion har studerats tydligare. Med andra ord, orsaken till att inte kräva studie av UGTase -induktion är att mekanismen fortfarande är oklar; Detta betyder dock inte att UGTase inte kommer att induceras. Riktlinjerna anger också att det inte finns något standardiserat klassificeringssystem för inducerare eller hämmare av transportörer och fas II -metabolismenzymer.
F: Hur länge kan vidhäftande primära hepatocyter överleva efter återupplivning, och hur länge kan hepatocyter upprätthållas utan vidhäftande kultur efter återupplivning?
S: Pastöriserade primära hepatocyter används vanligtvis för enzyminduktionsanalyser. Efter cellåtervinning suspenderas celler i plattspridningsmedium, justeras till lämplig koncentration och odlas i kollagen - belagda plattor; Då kan celler pastöriseras inom 4 ~ 6 timmar. Efter att cellerna är fästa vid väggen ersätts underhållsmediet och underhålls under 18 timmar för att säkerställa maximal återställande av cellstillstånd. Därefter kan enzyminduktionsanalys utföras för att detektera metabolisk aktivitet och mRNA -induktionsnivå. Från hela cykelns perspektiv kan hepatocyter upprätthållas i 6 ~ 7 dagar efter väggens vidhäftning. När tiden går, försämras cellväggens vidhäftningstillstånd, och cellerna kommer att lossna och avbryta.
Om de vidhäftande hepatocyterna inte odlas har vi verifierat att de kan upprätthållas i ett bra tillstånd inom 4 ~ 6 timmar. Vi har ännu inte genomfört verifiering under en längre period.
F: Hepatocyter kan användas som både suspension och vidhäftande celler beroende på de olika odlingsmedier som används?
S: De flesta celler från fasta vävnader och organ är muromgärdade, men inte alla celler är muromgärdade när de odlas i - vitro. Huruvida cellerna är vägg - vidhäftande eller inte beror på själva cellernas tillstånd; Samtidigt behöver vägg - vidhäftande celler specifikt odlingsmedium och vissa speciella pro - cell vidhäftningsämnen (t.ex. rhamnogelinogen, laminin, fibronektin, serumutvidgningsfaktor) som kan delta i cellfästningsprocessen. Sammanfattningsvis kan vidhäftande celler användas som suspensionsceller, men suspensionsceller är inte nödvändigtvis tillgängliga för vidhäftande användning.
F: Vilka är fördelarna/nackdelarna med att använda vidhäftande väggvers hepatocyter? Vilka är beslutskriterierna?
S: Efter att hepatocyter är isolerade kan de odlas i suspension eller i vidhäftande vägg. Aktiviteten hos cytokrom P450 -enzym från suspension odlade primära hepatocyter är mest förenlig med den av i - vivo för de första 4 ~ 6h, och minskar sedan snabbt med förlängningen av tiden. Därför används suspensionshepatocyter vanligtvis för metabolisk stabilitetsstudie eller metabolitprofileringsstudie. Primära hepatocyter odlade i vidhäftande vägg har tillräckligt med tid att återhämta sig från skador för att upprätthålla de biologiska egenskaperna och metaboliska aktiviteten hos normala hepatocyter. Därför används de i allmänhet för enzyminduktionsstudier, läkemedelscytotoxicitetsstudier, metabolisk stabilitet av långsamma metaboliserande läkemedel eller produktinferensstudier.
För närvarande tillhandahåller vi inte webbsidan online köpstjänst. Produkterna som läggs till i kundvagnen efter registrering och inloggning är endast för referens. Om du behöver köpa våra produkter, vänligen lämna din kontaktinformation via Contact US -kanalen, så kommer vi att kontakta dig i tid för att slutföra våra tjänster.
F ： Hur påverkar icke -- specifikt proteinbindning testresultat?
A ： Om läkemedelskandidaten binder icke - specifikt till mikrosomala proteiner, resulterar detta i förändrade kinetiska parametrar. När proteinkoncentrationen ökar ökar KM -värdet, vilket resulterar i en låg antagen inneboende clearance. Bindningen av läkemedelskandidaten till proteiner i mikrosomer kan också resultera i stora variationer i resultat från olika laboratorier och olika system.
Q ： Den rekommenderade koncentrationen av levermikrosomalt protein i instruktionshandboken för fas I eller fas II -metabolisk stabilitetssats är 0,1 mg/ml - 1 mg/ml, betyder det att när du använder levermikrosomer är det fortfarande nödvändigt att späda dem väl innan du lägger till dem i systemet?
A: Det finns inget behov av att utspäda levermikrosomerna först; Koncentrationen av levermikrosomer i satsen är 20 mg/ml och den slutliga koncentrationen av levermikrosomer i testsystemet är 0,1 - 1 mg/ml, som kan tillsättas proportionellt.
F ： Vad är den rekommenderade celltätheten för metabolisk stabilitetstest av primära hepatocyter? Är clearance -beräkningen densamma som för levermikrosomer?
A ： Den rekommenderade celltätheten för den primära hepatocytmetaboliska stabilitetsanalysen är 0,5 till 2 × 106 Celler/ML, och clearance -beräkningarna och behandlingen av resultaten av metabolisk metabolisk stabilitetsanalys för lever är konsekvent.
F ： Vilka är de viktigaste ingredienserna i din PBS -buffert? Innehåller den KCL och NaCl?
A ： Huvudkomponenterna i vår PBS -buffert är k2Hpo4 och kh2PO4och är fria från KCl och NaCl.
F ： Vad är syftet med fosfatbuffertar? Varför behöver du fosfat?
A ： Fosfatbuffertar väljs för sitt syfte att efterlikna den fysiologiska miljön, och fosfat är ett av de viktigaste buffertparen för att upprätthålla kroppens flytande miljö.
F ： Vad är den vanliga inställningen för enzym - inducerad receptorkoncentration? Finns det någon lösning om lösligheten för systemet som ska testas är dålig?
En ： Enzyminduktionsanalysen måste ställas in med 3 olika koncentrationer, koncentrationsnivån måste täcka den förväntade effektiva blodläkemedelskoncentrationen hos människor, och den högsta koncentrationen väljs att vara minst en storleksordning högre än den genomsnittliga effektiva blodkoncentrationen hos människor. Om lösligheten i vattenfasen är dålig kan ett organiskt lösningsmedel väljas som sitt lösningsmedel, t.ex. DMSO, men mängden organiskt lösningsmedel som läggs till i systemet måste kontrolleras.
F ： I metaboliska stabilitetsstudier, är det nödvändigt att använda två testsystem, levermikrosomer och primära hepatocyter, för testning?
A ： Mikrosomer i lever är nästan sfärisk membranvesikel - som strukturer som bildas av själv - fusion av fragmenterade endoplasmiska retikulum erhållna under homogenisering och differentiell centrifugering av levervävnader, och innehåller CYP450 -enzymer och några biphasiska enzymer, t.ex. ugts, STS. Primära hepatocyter (PHC) är hepatocyter odlade omedelbart efter direkt isolering från djurlever, som i princip upprätthåller leverens metaboliska funktioner, särskilt bättre att bevara enzymnivåerna som är förenliga med de in vivo. I den metaboliska stabilitetsstudien finns det ingen anledning att överväga kostnaden, och två testsystem kan väljas för testet samtidigt; eller det lämpliga testsystemet kan väljas enligt föreningens metaboliska egenskaper, och principen är att vilket system som har en hög metabolisk hastighet väljs. I allmänhet är levermikrosomer det bästa valet när föreningsmolekylerna är mer vatten - lösliga och en - fasmetabolism är den huvudsakliga metaboliska vägen (särskilt via CYP); När två - fasmetabolism är huvudvägen, är hydrolys den huvudsakliga metaboliska vägen, icke - Specifikt proteinbindning i levermikrosomerna är mycket hög, och metabolism är inte uppenbar i levermikrosomerna, kan testet utföras med primära hepatocyter.
F ： Är koncentrationen av mikrosomer undersökt i det metaboliska stabilitetstestet? Vad är effekten av för hög eller för låg?
En ： I det metaboliska stabilitetstestet kommer proteinkoncentrationen också att påverka metabolismhastigheten, vanligtvis väljer den mikrosomala proteinkoncentrationen av 0,1 mg/ml ~ 1 mg/ml, det specifika valet av hur mycket proteinkoncentration som ska väljas enligt föreningens egna metaboliska egenskaper. För hög en koncentration av mikrosomalt protein kommer att leda till icke -specifik bindning av läkemedlet till det mikrosomala proteinet; Även om en för låg koncentration av mikrosomalt protein kan leda till obetydlig metabolism av läkemedlet.