Swali: Je! Ninapaswaje kuchagua microsomes na hepatocytes kwa masomo ya utulivu wa metabolic? Je! Ninaweza kuchagua mmoja wao tu kutimiza hitaji?
J: Katika utafiti wa utulivu wa kimetaboliki, uchaguzi wa microsomes ya ini au hepatocytes hutegemea sana mali ya metabolic ya misombo, ambayo ile iliyo na kiwango cha juu cha metabolic huchaguliwa. Kwa ujumla, microsomes ya ini hupendelea, haswa wakati molekuli za kiwanja ni maji zaidi - mumunyifu na moja - kimetaboliki ya awamu ndio njia kuu ya metabolic (haswa kupitia CYP). Hepatocytes inaweza kutumika kwa majaribio wakati kuna ushahidi wa metaboli mbili za awamu kama njia kuu, hydrolysis kama njia kuu ya metabolic, protini ya juu isiyo na maana katika microsomes ya ini, na kimetaboliki katika microsomes ya ini haionekani. Kawaida, mfumo mmoja wa kimetaboliki unaweza kuchaguliwa kukidhi mahitaji; Ikiwa hali katika nyanja zote huruhusu, ni bora kuchagua mifumo yote kwa wakati mmoja.
Swali: Kwa nini ni muhimu kutumia hepatocytes za msingi kwa assay ya uingizwaji wa enzyme?
A: CYP Enzyme - assay iliyosababishwa inahitaji kutoka "maandishi", "tafsiri" hadi "chapisho - tafsiri ya protini" kupata protini ya enzyme ya CYP. Kwa hivyo, mfumo wa mtihani unapaswa kuwa seli za ini, sio microsomes ya ini au ini S9.
Swali: Kwa nini ninahitaji kuchagua hepatocytes tatu za msingi za wafadhili kwa assay ya enzyme?
J: Kulingana na utangulizi wa miongozo ya mwingiliano wa dawa, angalau wafadhili watatu wanapaswa kutumiwa, na matokeo ya induction ya kila wafadhili yanapaswa kutathminiwa tofauti. Mbali na kutoa matokeo muhimu ya takwimu, uchaguzi wa wafadhili watatu kwa jaribio hilo pia ni muhimu zaidi kwa kutathmini tofauti za mtu binafsi. Ikiwa matokeo kutoka kwa wafadhili angalau moja yanazidi kizingiti kilichopangwa, mgombeaji wa dawa anaweza kuwa mbaya na kufuata - tathmini inahitajika.
Swali: Kwa nini kuzingatia tu uingizwaji wa enzyme ya CYP na sio juu ya induction ya enzyme ya UGT?
Jibu: Sababu ya kuzingatia ujanibishaji wa Cypase ni kwamba utaratibu wa ujanibishaji wa Cypase umesomwa wazi zaidi. Kwa maneno mengine, sababu ya kutohitaji uchunguzi wa ujanibishaji wa ugtase ni kwamba utaratibu bado haueleweki; Walakini, hii haimaanishi kuwa ugtase haitasababishwa. Miongozo hiyo pia inasema kuwa hakuna mfumo wa uainishaji uliosimamishwa kwa inducers au vizuizi vya wasafiri na enzymes ya kimetaboliki ya Awamu ya II.
Swali: Je! Hepatocytes za msingi zinaweza kuishi kwa muda gani baada ya kuanza tena, na hepatocytes zinaweza kudumishwa kwa muda gani bila utamaduni wa kuambatana baada ya kuanza tena?
Jibu: Hepatocytes za msingi za Pasteurized kwa ujumla hutumiwa kwa uainishaji wa enzyme. Baada ya kupona kwa seli, seli husimamishwa katika sahani inayoeneza kati, iliyorekebishwa kwa mkusanyiko unaofaa, na kuwekwa katika sahani za collagen - zilizofunikwa; Halafu seli zinaweza kuwekwa ndani ya masaa 4 ~ 6. Baada ya seli kushikamana na ukuta, kati ya matengenezo hubadilishwa na kutunzwa kwa 18 h ili kuhakikisha kuwa marejesho ya hali ya seli. Ifuatayo, assay ya induction ya enzyme inaweza kufanywa ili kugundua shughuli za kimetaboliki na kiwango cha induction ya mRNA. Kwa mtazamo wa mzunguko mzima, hepatocytes zinaweza kudumishwa kwa siku 6 ~ 7 baada ya kufuata ukuta. Kadiri wakati unavyopita, hali ya kufuata ukuta wa seli inazidi kuzorota, na seli zitafunguka na kusimamisha.
Ikiwa hepatocytes za kuambatana hazijasafishwa, tumethibitisha kuwa zinaweza kutunzwa katika hali nzuri ndani ya masaa 4 ~ 6. Bado hatujafanya uthibitisho kwa muda mrefu zaidi.
Swali: Hepatocytes inaweza kutumika kama seli zote za kusimamishwa na za kufuata kulingana na media tofauti za kitamaduni zinazotumiwa?
Jibu: Seli nyingi kutoka kwa tishu ngumu na viungo vimepigwa ukuta, lakini sio seli zote zilizo na ukuta wakati zinapowekwa ndani ya - vitro. Ikiwa seli ni ukuta - zinaambatana au sio inategemea hali ya seli zenyewe; Wakati huo huo, seli - seli zinazofuata zinahitaji utamaduni maalum wa kati na vitu maalum vya wambiso wa seli (k.m. rhamnogelinogen, laminin, fibronectin, sababu ya upanuzi wa serum) ambayo inaweza kushiriki katika mchakato wa kiambatisho cha seli. Kwa kumalizia, seli za kuambatana zinaweza kutumika kama seli za kusimamishwa, lakini seli za kusimamishwa hazipatikani kwa matumizi ya kuambatana.
Swali: Je! Ni faida gani/hasara za kutumia aya za kushikamana za ukuta wa kusimamishwa? Je! Ni vigezo gani vya uamuzi?
J: Baada ya hepatocytes kutengwa, zinaweza kubuniwa kwa kusimamishwa au kwa ukuta wa kuambatana. Shughuli ya enzyme ya cytochrome P450 kutoka kwa hepatocytes ya msingi ya kusimamishwa ni sawa na ile ya katika - vivo kwa 4 ~ 6h ya kwanza, kisha hupungua haraka na kuongeza muda. Kwa hivyo, hepatocytes za kusimamishwa kwa ujumla hutumiwa kwa utafiti wa utulivu wa metabolic au utafiti wa profiling ya metabolite. Hepatocytes ya msingi iliyoandaliwa katika ukuta wa kufuata ina wakati wa kutosha kupona kutokana na uharibifu ili kudumisha tabia ya kibaolojia na shughuli za kimetaboliki za hepatocytes za kawaida. Kwa hivyo, kwa ujumla hutumiwa kwa masomo ya ujanibishaji wa enzyme, masomo ya cytotoxicity ya dawa, utulivu wa metabolic wa dawa za kulevya polepole au masomo ya uelekezaji wa bidhaa.
Hivi sasa, hatutoi huduma ya ununuzi wa wavuti mkondoni. Bidhaa zilizoongezwa kwenye gari la ununuzi baada ya usajili na kuingia ni kwa kumbukumbu tu. Ikiwa unahitaji kununua bidhaa zetu, tafadhali acha habari yako ya mawasiliano kupitia kituo cha wasiliana nasi, na tutawasiliana nawe kwa wakati kukamilisha huduma zetu.
Q: Je! Ni vipi - proteni maalum inaathiri matokeo ya mtihani?
A: Ikiwa mgombeaji wa dawa hufunga sio - haswa kwa protini za microsomal, hii inasababisha vigezo vya kinetic vilivyobadilishwa. Kadiri mkusanyiko wa protini unavyoongezeka, thamani ya KM inapoongezeka, na kusababisha kibali cha chini cha ndani. Pia, kumfunga kwa mgombea wa dawa kwa protini kwenye microsomes kunaweza kusababisha tofauti kubwa katika matokeo kutoka kwa maabara tofauti na mifumo tofauti.
Q: Mkusanyiko uliopendekezwa wa protini ya microsomal ya ini katika mwongozo wa maagizo ya Awamu ya I au Awamu ya II ya kimetaboliki ni 0.1 mg/ml - 1 mg/ml, hii inamaanisha kuwa wakati wa kutumia microsomes ya ini, bado ni muhimu kuziongeza vizuri kabla ya kuwaongezea kwenye mfumo?
A: Hakuna haja ya kuongeza microsomes ya hepatic kwanza; Mkusanyiko wa microsomes ya hepatic kwenye kit ni 20 mg/ml na mkusanyiko wa mwisho wa microsomes ya hepatic katika mfumo wa mtihani ni 0.1 - 1 mg/ml, ambayo inaweza kuongezwa kwa usawa.
Q: Je! Ni nini wiani wa seli uliopendekezwa kwa upimaji wa utulivu wa metabolic wa hepatocytes za msingi? Je! Hesabu ya kibali ni sawa na kwa microsomes ya ini?
A: Uzani wa seli uliopendekezwa kwa uimara wa msingi wa metabolic ya hepatocyte ni 0.5 hadi 2 × 106 Seli/mL, na mahesabu ya kibali na usindikaji wa matokeo ya uimara wa metabolic ya hepatic ni thabiti.
Swali: Je! Ni viungo gani kuu kwenye buffer yako ya PBS? Je! Inayo KCl na NaCl?
A: Vipengele kuu vya buffer yetu ya PBS ni k2HPO4 na kh2PO4, na hawana KCL na NaCl.
Swali: Je! Kusudi la buffers ya phosphate ni nini? Kwa nini unahitaji phosphate?
A: Phosphate buffers huchaguliwa kwa madhumuni yao ya kuiga mazingira ya kisaikolojia, na phosphate ni moja ya jozi muhimu zaidi ya kudumisha mazingira ya maji ya mwili.
Swali: Je! Ni mpangilio gani wa kawaida wa enzyme - mkusanyiko wa receptor? Je! Kuna suluhisho ikiwa umumunyifu wa mfumo unaopimwa ni duni?
A: Assay ya uingizwaji wa enzyme inahitaji kuwekwa na viwango 3 tofauti, kiwango cha mkusanyiko kinahitaji kufunika mkusanyiko mzuri wa dawa ya damu kwa wanadamu, na mkusanyiko wa juu zaidi huchaguliwa kuwa angalau agizo moja la ukubwa wa juu kuliko mkusanyiko wa dawa ya damu kwa wastani kwa wanadamu. Ikiwa umumunyifu katika awamu ya maji ni duni, kutengenezea kikaboni kunaweza kuchaguliwa kama kutengenezea kwake, n.k. DMSO, lakini kiasi cha kutengenezea kikaboni kilichoongezwa kwenye mfumo kinahitaji kudhibitiwa.
Q: Katika masomo ya utulivu wa metabolic, ni muhimu kutumia mifumo miwili ya mtihani, microsomes ya ini na hepatocytes ya msingi, kwa upimaji?
A: Microsomes ya Hepatic ni karibu spherical membrane vesicle - kama miundo iliyoundwa na ubinafsi - fusion ya kugawanyika endoplasmic reticulum iliyopatikana wakati wa homogenisation na tofauti ya centrifugation ya tishu za hepatic, na zina Enzymes za CYP450 na enzymes za biphasic,. Hepatocytes ya msingi (PHCs) ni hepatocytes iliyoandaliwa mara baada ya kutengwa moja kwa moja kutoka kwa wanyama wa wanyama, ambayo kimsingi inadumisha kazi za metabolic za ini, haswa kuhifadhi viwango vya enzyme vinavyoendana na zile za vivo. Katika utafiti wa utulivu wa metabolic, hakuna haja ya kuzingatia gharama, na mifumo miwili ya majaribio inaweza kuchaguliwa kwa mtihani wakati huo huo; au mfumo unaofaa wa mtihani unaweza kuchaguliwa kulingana na mali ya kimetaboliki ya kiwanja, na kanuni ni ile ambayo mfumo una kiwango cha juu cha metabolic huchaguliwa. Kwa ujumla, microsomes ya ini ni chaguo bora wakati molekuli za kiwanja ni maji zaidi - mumunyifu na moja - metaboli ya awamu ndio njia kuu ya metabolic (haswa kupitia CYP); Wakati kimetaboliki mbili za awamu ndio njia kuu, hydrolysis ndio njia kuu ya metabolic, sio - protini maalum inayofunga kwenye microsomes ya ini ni kubwa sana, na kimetaboliki sio dhahiri katika microsomes ya ini, mtihani unaweza kufanywa kwa kutumia hepatocytes za msingi.
Swali: Je! Mkusanyiko wa microsomes unachunguzwa katika mtihani wa utulivu wa metabolic? Je! Ni nini athari ya juu sana au chini sana?
A: Katika mtihani wa utulivu wa metabolic, mkusanyiko wa protini pia utaathiri kiwango cha metabolic, kawaida huchagua mkusanyiko wa protini ya microsomal ya 0.1 mg/ml ~ 1 mg/ml, chaguo maalum la mkusanyiko wa protini unapaswa kuchaguliwa kulingana na mali ya kimetaboliki ya kiwanja. Mkusanyiko wa juu sana wa protini ya microsomal itasababisha isiyo ya - kumfunga kwa dawa hiyo kwa protini ya microsomal; Wakati mkusanyiko wa chini wa protini ya microsomal inaweza kusababisha kimetaboliki isiyo na maana ya dawa hiyo.