س: چگونه باید میکروزوم ها و سلولهای کبدی را برای مطالعات پایداری متابولیک انتخاب کنم؟ آیا می توانم فقط یکی از آنها را برای تحقق الزام انتخاب کنم؟
پاسخ: در مطالعه پایداری متابولیک ، انتخاب میکروزومهای کبد یا سلولهای کبدی عمدتا به خصوصیات متابولیک ترکیبات بستگی دارد ، که در آن یکی با میزان متابولیک بالا انتخاب می شود. به طور کلی ، میکروزومهای کبد ترجیح داده می شوند ، به ویژه هنگامی که مولکول های مرکب آب بیشتری دارند - محلول و یک فاز متابولیسم اصلی مسیر متابولیک (به ویژه از طریق CYP) است. سلولهای کبدی ممکن است برای آزمایشات مورد استفاده قرار گیرند که شواهدی از متابولیسم فاز به عنوان مسیر اصلی ، هیدرولیز به عنوان مسیر اصلی متابولیک ، اتصال پروتئین غیر اختصاصی در میکروزوم های کبدی و متابولیسم در میکروزوم های کبد وجود ندارد. معمولاً یک سیستم متابولیک می تواند برای تأمین نیازها انتخاب شود. اگر شرایط در همه جنبه ها اجازه می دهد ، قطعاً بهتر است هر دو سیستم را همزمان انتخاب کنید.
س: چرا استفاده از سلولهای کبدی اولیه برای سنجش القاء آنزیم ضروری است؟
پاسخ: آنزیم CYP - سنجش ناشی از "رونویسی" ، "ترجمه" به "پس از - اصلاح ترجمه پروتئین" برای به دست آوردن یک پروتئین فعال آنزیم CYP. بنابراین ، سیستم آزمایش باید سلولهای کبدی باشد ، نه میکروزوم کبد یا کبد S9.
س: چرا من نیاز به انتخاب سه سلولهای کبدی اولیه انسانی برای سنجش القاء آنزیم دارم؟
پاسخ: طبق مقدمه دستورالعمل های مربوط به فعل و انفعالات دارویی ، حداقل باید از سه اهدا کننده استفاده شود و نتیجه القایی هر اهدا کننده باید به طور جداگانه ارزیابی شود. علاوه بر تولید نتایج آماری معنی دار ، انتخاب سه اهدا کننده برای آزمایش نیز برای ارزیابی تنوع فردی از اهمیت بیشتری برخوردار است. اگر نتیجه حداقل یک اهدا کننده بیش از یک آستانه از پیش تعیین شده باشد ، نامزد دارو ممکن است القاء شود و ارزیابی پیگیری شود -
س: چرا فقط روی القاء آنزیم CYP تمرکز می کنید و نه بر القای آنزیم UGT؟
پاسخ: دلیل تمرکز روی القاء CYPASE این است که مکانیسم القاء CYPASE با وضوح بیشتری مورد مطالعه قرار گرفته است. به عبارت دیگر ، دلیل عدم نیاز به مطالعه القاء اوگتاز این است که مکانیسم هنوز نامشخص است. با این حال ، این بدان معنی نیست که اوگتاز القا نمی شود. در این دستورالعمل ها همچنین بیان می شود که هیچ سیستم طبقه بندی استاندارد برای القا کننده ها یا مهار کننده های حمل و نقل و آنزیم های متابولیسم فاز II وجود ندارد.
س: چه مدت می تواند سلولهای کبدی اولیه پس از احیا زنده بمانند و چه مدت می تواند سلولهای کبدی بدون فرهنگ پایبندی پس از احیا حفظ شود؟
پاسخ: سلولهای کبدی اولیه پاستوریزه به طور کلی برای سنجش های القاء آنزیم استفاده می شوند. پس از بازیابی سلول ، سلول ها در محیط پخش صفحه به حالت تعلیق در می آیند ، به غلظت مناسب تنظیم می شوند و در صفحات روکش شده با کلاژن کشت می شوند. سپس سلول ها می توانند طی 4 ~ 6 ساعت پاستوریزه شوند. پس از اتصال سلول ها به دیوار ، محیط نگهداری به مدت 18 ساعت تعویض و نگهداری می شود تا حداکثر ترمیم حالت سلول اطمینان حاصل شود. در مرحله بعد ، روش القایی آنزیم می تواند برای تشخیص فعالیت متابولیک و سطح القاء mRNA انجام شود. از منظر کل چرخه ، سلولهای کبدی می توانند به مدت 6 ~ 7 روز پس از پایبندی دیوار نگهداری شوند. با گذشت زمان ، وضعیت پایبندی دیواره سلولی بدتر می شود و سلول ها جدا می شوند و به حالت تعلیق در می آیند.
اگر سلولهای کبدی پیرو کشت نشوند ، ما تأیید کرده ایم که آنها می توانند طی 4 ~ 6 ساعت در حالت خوبی نگهداری شوند. ما هنوز برای مدت طولانی تر تأیید را انجام نداده ایم.
س: سلولهای کبدی بسته به رسانه های مختلف کشت مورد استفاده می توانند به عنوان سلولهای تعلیق و چسبنده استفاده شوند؟
پاسخ: بیشتر سلولها از بافتهای جامد و اندامها دیواره می شوند ، اما همه سلولها هنگام کشت در - in vitro دیواره نمی شوند. این که آیا سلول ها به صورت دیواری - چسبنده هستند یا خیر ، بستگی به وضعیت خود سلول ها دارد. در همین زمان ، سلولهای چسبنده به محیط خاص و برخی از مواد چسبندگی سلول خاص نیاز دارند (به عنوان مثال ، Rhamnogelinogen ، لامینین ، فیبرونکتین ، فاکتور گسترش سرم) که ممکن است در فرآیند اتصال سلول شرکت کنند. در نتیجه ، سلولهای چسبنده می توانند به عنوان سلولهای تعلیق مورد استفاده قرار گیرند ، اما سلولهای تعلیق لزوماً برای استفاده چسبنده در دسترس نیستند.
س: مزایا/مضرات استفاده از آیات دیواری چسبنده تعلیق سلولهای کبدی چیست؟ معیارهای تصمیم گیری چیست؟
پاسخ: پس از جدا شدن سلولهای کبدی ، می توان آنها را در حالت تعلیق یا در دیوار چسبنده کشت داد. فعالیت آنزیم سیتوکروم P450 از سلولهای کبدی اولیه کشت شده با سیستم در - vivo برای 4 ~ 6 ساعت اول سازگار است ، سپس با طولانی شدن زمان به سرعت کاهش می یابد. بنابراین ، سلولهای کبدی تعلیق به طور کلی برای مطالعه پایداری متابولیک یا مطالعه پروفایل متابولیت استفاده می شوند. سلولهای کبدی اولیه که در دیواره چسبنده کشت داده می شوند ، زمان کافی برای بهبودی از آسیب ها برای حفظ خصوصیات بیولوژیکی و فعالیت متابولیک سلولهای کبدی طبیعی دارند. از این رو ، آنها به طور کلی برای مطالعات القاء آنزیم ، مطالعات سمیت سلولی دارو ، پایداری متابولیک داروهای متابولیزه آهسته یا مطالعات استنتاج محصول استفاده می شوند.
در حال حاضر ، ما خدمات خرید آنلاین صفحه وب را ارائه نمی دهیم. محصولات اضافه شده به سبد خرید پس از ثبت نام و ورود به سیستم فقط برای مرجع هستند. اگر نیاز به خرید محصولات ما دارید ، لطفاً اطلاعات تماس خود را از طریق کانال Contact US بگذارید و ما به موقع با شما تماس خواهیم گرفت تا خدمات خود را انجام دهیم.
س ： چگونه اتصال پروتئین غیر - خاص بر نتایج آزمون تأثیر می گذارد؟
A ： اگر نامزد دارو غیر - به طور خاص به پروتئین های میکروزومی متصل شود ، این منجر به پارامترهای جنبشی تغییر یافته می شود. با افزایش غلظت پروتئین ، مقدار کیلومتر افزایش می یابد ، و در نتیجه باعث کمبود ذاتی فرض می شود. همچنین ، اتصال نامزد دارو به پروتئین ها در میکروزومها می تواند منجر به تغییرات زیادی در نتایج آزمایشگاه های مختلف و سیستم های مختلف شود.
Q ： غلظت توصیه شده پروتئین میکروزومی کبد در کتابچه راهنمای دستورالعمل کیت پایداری فاز I یا فاز II 0.1 میلی گرم در میلی لیتر - 1 میلی گرم در میلی لیتر است ، آیا این بدان معنی است که هنگام استفاده از میکروزوم های کبد ، هنوز هم لازم است قبل از اضافه کردن آنها به سیستم رقیق شود؟
الف: ابتدا نیازی به رقیق کردن میکروزوم های کبدی نیست. غلظت میکروزومهای کبدی در کیت 20 میلی گرم در میلی لیتر و غلظت نهایی میکروزوم های کبدی در سیستم آزمایش 0.1 - 1 میلی گرم در میلی لیتر است که می تواند متناسب اضافه شود.
س ： چگالی سلول توصیه شده برای آزمایش پایداری متابولیک سلولهای کبدی اولیه چیست؟ آیا محاسبه ترخیص کالا از گمرک همانند میکروزوم های کبد است؟
A ： چگالی سلول توصیه شده برای روش ثبات متابولیک سلولهای کبدی اولیه 0.5 تا 2 2 است6 سلول ها/میلی لیتر ، و محاسبات ترخیص کالا از گمرک و پردازش نتایج حاصل از روش پایداری متابولیک میکروزومی کبدی سازگار است.
س ： مواد اصلی در بافر PBS شما چیست؟ آیا حاوی KCL و NaCl است؟
A ： اجزای اصلی بافر PBS ما K هستند2HPO4 و k2PO4، و عاری از KCL و NaCl هستند.
س ： هدف از بافر فسفات چیست؟ چرا به فسفات احتیاج دارید؟
A بافر فسفات به منظور تقلید از محیط فیزیولوژیکی انتخاب می شود و فسفات یکی از مهمترین جفت بافر برای حفظ محیط سیال بدن است.
س ： تنظیم معمول آنزیم - غلظت گیرنده ناشی از آن چیست؟ آیا در صورت حلالیت سیستم مورد آزمایش ، راه حلی وجود دارد؟
A ： روش القایی آنزیم باید با 3 غلظت مختلف تنظیم شود ، سطح غلظت باید غلظت مؤثر داروی خون را در انسان پوشش دهد و بیشترین غلظت به حداقل یک مرتبه بیشتر از میانگین غلظت مؤثر داروی خون در انسان انتخاب می شود. اگر حلالیت در فاز آبی ضعیف باشد ، می توان یک حلال آلی را به عنوان حلال آن انتخاب کرد ، به عنوان مثال DMSO ، اما میزان حلال آلی اضافه شده به سیستم باید کنترل شود.
س ： در مطالعات پایداری متابولیک ، آیا استفاده از دو سیستم آزمایش ، میکروزوم کبد و سلولهای کبدی اولیه برای آزمایش لازم است؟
میکروزومهای کبدی ： کبدی تقریباً وزیکول غشای کروی هستند - مانند ساختارهایی که توسط خود - تلفیقی از شبکه آندوپلاسمی تکه تکه شده به دست آمده در طول همگن سازی و سانتریفیوژ دیفرانسیل بافتهای کبدی و حاوی آنزیم های CYP450 و برخی از آنزیم های بیفازی ، به عنوان مثال ، Ug ، ugts ، sts است. سلولهای کبدی اولیه (PHC) سلولهای کبدی بلافاصله پس از جداسازی مستقیم از کبد حیوانات کشت داده می شوند ، که اساساً عملکردهای متابولیکی کبد را حفظ می کنند ، به خصوص حفظ بهتر آنزیم سازگار با آنهایی که در داخل بدن هستند. در مطالعه پایداری متابولیک ، نیازی به در نظر گرفتن هزینه نیست و دو سیستم آزمایشی همزمان می توانند برای آزمون انتخاب شوند. یا سیستم آزمایش مناسب را می توان با توجه به خصوصیات متابولیک ترکیب انتخاب کرد و اصل این است که سیستم دارای میزان متابولیکی بالایی است. به طور کلی ، میکروزومهای کبدی بهترین انتخاب هستند که مولکول های مرکب آب بیشتری داشته باشند - محلول و یک - فاز متابولیسم اصلی مسیر متابولیک (به ویژه از طریق CYP) است. هنگامی که متابولیسم دو فاز مسیر اصلی است ، هیدرولیز مسیر اصلی متابولیک است ، اتصال پروتئین غیر - خاص در میکروزومهای کبد بسیار زیاد است و متابولیسم در میکروزوم های کبد آشکار نیست ، آزمایش می تواند با استفاده از سلولهای کبدی اولیه انجام شود.
س ： آیا غلظت میکروزوم ها در آزمایش پایداری متابولیک مورد بررسی قرار می گیرد؟ تأثیر خیلی زیاد یا خیلی کم چیست؟
A ： در تست پایداری متابولیک ، غلظت پروتئین نیز بر میزان متابولیک تأثیر می گذارد ، معمولاً غلظت پروتئین میکروزومال 0.1 میلی گرم در میلی لیتر ~ 1 میلی گرم در میلی لیتر ، انتخاب خاص میزان غلظت پروتئین با توجه به خاصیت متابولیک خود ترکیب را انتخاب می کند. غلظت پروتئین میکروزومی بیش از حد زیاد منجر به اتصال غیر - خاص دارو به پروتئین میکروزومال می شود. در حالی که غلظت پروتئین میکروزومی بیش از حد کم ممکن است منجر به متابولیسم ناچیز دارو شود.