ถาม: ฉันควรเลือก microsomes และ hepatocytes สำหรับการศึกษาเสถียรภาพเมตาบอลิซึมได้อย่างไร? ฉันสามารถเลือกเพียงหนึ่งในนั้นเพื่อตอบสนองความต้องการได้หรือไม่?
ตอบ: ในการศึกษาความเสถียรในการเผาผลาญอาหารทางเลือกของตับไมโครหรือเซลล์ตับส่วนใหญ่ขึ้นอยู่กับคุณสมบัติการเผาผลาญของสารประกอบซึ่งมีการเลือกอัตราการเผาผลาญสูง โดยทั่วไปแล้ว microsomes ตับเป็นที่ต้องการโดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อโมเลกุลผสมมีน้ำมากขึ้น - ละลายได้และการเผาผลาญเฟสหนึ่งครั้งเป็นเส้นทางการเผาผลาญหลัก (โดยเฉพาะผ่าน CYP) เซลล์ตับอาจใช้สำหรับการทดลองเมื่อมีหลักฐานของการเผาผลาญเฟสสอง - เป็นเส้นทางสำคัญการไฮโดรไลซิสเป็นเส้นทางการเผาผลาญที่สำคัญการจับโปรตีนที่ไม่จำเพาะสูงใน microsomes ตับและการเผาผลาญในตับไมโครโซม โดยปกติจะสามารถเลือกระบบเมตาบอลิซึมหนึ่งระบบเพื่อตอบสนองความต้องการ หากเงื่อนไขในทุกด้านอนุญาตให้เลือกทั้งสองระบบในเวลาเดียวกัน
ถาม: เหตุใดจึงจำเป็นต้องใช้เซลล์ตับหลักสำหรับการทดสอบการเหนี่ยวนำเอนไซม์?
A: CYP Enzyme - การทดสอบที่เกิดขึ้นจะต้องเปลี่ยนจาก "การถอดความ", "การแปล" เป็น "โพสต์ - การปรับเปลี่ยนโปรตีน" เพื่อให้ได้โปรตีนเอนไซม์ CYP ที่ใช้งานอยู่ ดังนั้นระบบทดสอบควรเป็นเซลล์ตับไม่ใช่ microsomes ตับหรือตับ S9
ถาม: ทำไมฉันต้องเลือกเซลล์ตับหลักของมนุษย์สามคนสำหรับการทดสอบการเหนี่ยวนำเอนไซม์?
ตอบ: ตามคำแนะนำเกี่ยวกับแนวทางสำหรับการมีปฏิสัมพันธ์ยาเสพติดควรใช้ผู้บริจาคอย่างน้อยสามรายและผลการเหนี่ยวนำของผู้บริจาคแต่ละคนควรได้รับการประเมินแยกกัน นอกเหนือจากการผลิตผลลัพธ์ที่มีนัยสำคัญทางสถิติทางเลือกของผู้บริจาคสามคนสำหรับการทดลองก็มีความสำคัญมากกว่าสำหรับการประเมินการเปลี่ยนแปลงระหว่างกัน หากผลลัพธ์จากผู้บริจาคอย่างน้อยหนึ่งคนเกินเกณฑ์ที่กำหนดไว้ล่วงหน้าผู้สมัครยาอาจจะเหนี่ยวนำให้เกิดและติดตามการประเมินผล
ถาม: ทำไมต้องมุ่งเน้นเฉพาะการเหนี่ยวนำเอนไซม์ CYP และไม่ได้อยู่ในการเหนี่ยวนำของเอนไซม์ UGT?
ตอบ: เหตุผลในการมุ่งเน้นไปที่การเหนี่ยวนำ CYPASE คือกลไกของการเหนี่ยวนำ CYPASE ได้รับการศึกษาอย่างชัดเจนมากขึ้น กล่าวอีกนัยหนึ่งเหตุผลที่ไม่ต้องการการศึกษาการเหนี่ยวนำ Ugtase ก็คือกลไกยังไม่ชัดเจน อย่างไรก็ตามนี่ไม่ได้หมายความว่า UGTase จะไม่ถูกเหนี่ยวนำ แนวทางดังกล่าวยังระบุว่าไม่มีระบบการจำแนกประเภทมาตรฐานสำหรับตัวเหนี่ยวนำหรือสารยับยั้งการขนส่งและเอนไซม์เมตาบอลิซึมของระยะที่สอง
ถาม: เซลล์ตับหลักสามารถอยู่รอดได้นานแค่ไหนหลังจากการช่วยชีวิตและเซลล์ตับสามารถรักษาได้นานแค่ไหนโดยไม่ต้องมีวัฒนธรรมการยึดมั่นหลังจากการช่วยชีวิต?
ตอบ: เซลล์ตับปฐมภูมิปฐมภูมิโดยทั่วไปใช้สำหรับการตรวจหาเอนไซม์ หลังจากการฟื้นตัวของเซลล์เซลล์จะถูกแขวนอยู่ในตัวกลางการแพร่กระจายของจานปรับให้เข้ากับความเข้มข้นที่เหมาะสมและเพาะเลี้ยงในคอลลาเจน - แผ่นเคลือบ จากนั้นเซลล์สามารถพาสเจอร์ไรส์ภายใน 4 ~ 6 ชั่วโมง หลังจากที่เซลล์ติดอยู่กับผนังสื่อการบำรุงรักษาจะถูกแทนที่และบำรุงรักษาเป็นเวลา 18 ชั่วโมงเพื่อให้แน่ใจว่าการฟื้นฟูสถานะเซลล์สูงสุด ถัดไปการทดสอบการเหนี่ยวนำของเอนไซม์สามารถดำเนินการเพื่อตรวจจับกิจกรรมการเผาผลาญและระดับการเหนี่ยวนำ mRNA จากมุมมองของวงจรทั้งหมดเซลล์ตับสามารถรักษาได้เป็นเวลา 6 ~ 7 วันหลังจากการยึดติดกับผนัง เมื่อเวลาผ่านไปสถานะการยึดติดผนังเซลล์จะลดลงและเซลล์จะแยกและระงับ
หากเซลล์ตับที่ยึดมั่นไม่ได้รับการเพาะเลี้ยงเราได้ตรวจสอบว่าพวกเขาสามารถรักษาได้ในสภาวะที่ดีภายใน 4 ~ 6 ชั่วโมง เรายังไม่ได้ทำการตรวจสอบเป็นเวลานาน
ถาม: เซลล์ตับสามารถใช้เป็นทั้งเซลล์ช่วงล่างและเซลล์สานุศิษย์ขึ้นอยู่กับสื่อวัฒนธรรมที่แตกต่างกันที่ใช้?
ตอบ: เซลล์ส่วนใหญ่จากเนื้อเยื่อและอวัยวะที่เป็นของแข็งนั้นมีกำแพงล้อมรอบ แต่ไม่ใช่เซลล์ทั้งหมดที่มีกำแพงล้อมรอบเมื่อเพาะเลี้ยงใน - หลอดทดลอง ไม่ว่าเซลล์จะเป็นผนัง - ยึดมั่นหรือไม่ขึ้นอยู่กับสถานะของเซลล์เอง ในเวลาเดียวกันผนัง - เซลล์ที่ยึดมั่นจำเป็นต้องใช้สื่อการเพาะเลี้ยงที่เฉพาะเจาะจงและสารยึดเกาะแบบพิเศษของเซลล์ (เช่น Rhamnogelinogen, laminin, fibronectin, ปัจจัยการขยายตัวของซีรั่ม) ซึ่งอาจมีส่วนร่วมในกระบวนการของเซลล์ที่แนบมา โดยสรุปเซลล์ที่ยึดมั่นสามารถใช้เป็นเซลล์แขวนลอย แต่เซลล์ช่วงล่างไม่จำเป็นต้องใช้สำหรับการใช้งานที่ยึดมั่น
ถาม: อะไรคือข้อดี/ข้อเสียของการใช้โองการผนังที่มีการสานุศิษย์ เกณฑ์การตัดสินใจคืออะไร?
ตอบ: หลังจากเซลล์ตับถูกแยกออกแล้วพวกเขาสามารถเพาะเลี้ยงได้ในการระงับหรือในผนังสานุศิษย์ กิจกรรมของเอนไซม์ cytochrome P450 จากการระงับการเพาะเลี้ยงเซลล์ตับปฐมภูมินั้นสอดคล้องกับใน - vivo สำหรับ 4 ~ 6h แรกจากนั้นจะลดลงอย่างรวดเร็วเมื่อยืดเวลา ดังนั้นเซลล์ตับระงับโดยทั่วไปจะใช้สำหรับการศึกษาความมั่นคงเมตาบอลิซึมหรือการศึกษาโปรไฟล์เมตาบอไลต์ เซลล์ตับปฐมภูมิที่เพาะเลี้ยงในผนังยึดมั่นมีเวลาเพียงพอที่จะกู้คืนจากความเสียหายเพื่อรักษาลักษณะทางชีวภาพและกิจกรรมการเผาผลาญของเซลล์ตับปกติ ดังนั้นโดยทั่วไปจะใช้สำหรับการศึกษาการเหนี่ยวนำเอนไซม์, การศึกษาความเป็นพิษต่อเซลล์ยา, ความเสถียรของการเผาผลาญของยาเมแทบอลิซึมช้าหรือการศึกษาการอนุมานผลิตภัณฑ์
ขณะนี้เราไม่ได้ให้บริการซื้อออนไลน์หน้าเว็บ ผลิตภัณฑ์ที่เพิ่มเข้ามาในตะกร้าสินค้าหลังจากการลงทะเบียนและเข้าสู่ระบบสำหรับการอ้างอิงเท่านั้น หากคุณต้องการซื้อผลิตภัณฑ์ของเราโปรดทิ้งข้อมูลการติดต่อของคุณผ่านช่องทางติดต่อเราและเราจะติดต่อคุณทันเวลาเพื่อให้บริการของเราเสร็จสมบูรณ์
Q： การผูกโปรตีนที่ไม่เฉพาะเจาะจงมีผลต่อผลการทดสอบอย่างไร
A： หากผู้สมัครยาจับไม่ใช่โดยเฉพาะกับโปรตีน microsomal สิ่งนี้จะส่งผลให้พารามิเตอร์จลน์ที่เปลี่ยนแปลง เมื่อความเข้มข้นของโปรตีนเพิ่มขึ้นค่า KM จะเพิ่มขึ้นทำให้เกิดการกวาดล้างภายในที่ต่ำ นอกจากนี้การผูกมัดของผู้สมัครยากับโปรตีนในไมโครโซมอาจส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงอย่างมากในผลลัพธ์จากห้องปฏิบัติการที่แตกต่างกันและระบบที่แตกต่างกัน
Q： ความเข้มข้นที่แนะนำของโปรตีน microsomal ตับในคู่มือการใช้งานของชุดเฟส I หรือเฟส II ชุดเสถียรภาพการเผาผลาญเฟส II คือ 0.1 mg/ml - 1 mg/ml นี่หมายความว่าเมื่อใช้ microsomes ตับมันยังจำเป็นที่จะเจือจางได้ดีก่อนที่จะเพิ่มลงในระบบหรือไม่?
A: ไม่จำเป็นต้องเจือจางไมโครโซมตับก่อน ความเข้มข้นของไมโครโซมตับในชุดคือ 20 มก./มล. และความเข้มข้นสุดท้ายของไมโครโซมตับในระบบทดสอบคือ 0.1 - 1 มก./มล. ซึ่งสามารถเพิ่มสัดส่วนได้
Q： ความหนาแน่นของเซลล์ที่แนะนำสำหรับการทดสอบเสถียรภาพของเมตาบอลิซึมของเซลล์ตับหลักคืออะไร? การคำนวณการกวาดล้างเป็นเช่นเดียวกับ microsomes ตับหรือไม่?
A： ความหนาแน่นของเซลล์ที่แนะนำสำหรับการทดสอบความเสถียรของเมตาบอลิซึมตับหลักคือ 0.5 ถึง 2 × 106 เซลล์/มิลลิลิตรและการคำนวณระยะห่างและการประมวลผลของผลลัพธ์ของการทดสอบความเสถียรของการเผาผลาญ microsomal ในตับนั้นสอดคล้องกัน
Q： ส่วนผสมหลักในบัฟเฟอร์ PBS ของคุณคืออะไร? มันมี KCL และ NaCl หรือไม่?
a： องค์ประกอบหลักของบัฟเฟอร์ PBS ของเราคือ K2HPO4 และ kh2PO4และปราศจาก KCL และ NaCl
Q： จุดประสงค์ของบัฟเฟอร์ฟอสเฟตคืออะไร? ทำไมคุณถึงต้องการฟอสเฟต?
A： บัฟเฟอร์ฟอสเฟตถูกเลือกเพื่อจุดประสงค์ในการเลียนแบบสภาพแวดล้อมทางสรีรวิทยาและฟอสเฟตเป็นหนึ่งในคู่บัฟเฟอร์ที่สำคัญที่สุดสำหรับการรักษาสภาพแวดล้อมของเหลวของร่างกาย
Q： การตั้งค่าปกติสำหรับเอนไซม์ - ความเข้มข้นของตัวรับที่เกิดขึ้นคืออะไร? มีวิธีแก้ปัญหาหรือไม่หากความสามารถในการละลายของระบบที่จะทดสอบนั้นไม่ดี?
A： การทดสอบการเหนี่ยวนำเอนไซม์จำเป็นต้องได้รับการตั้งค่าด้วยความเข้มข้น 3 ระดับที่แตกต่างกันระดับความเข้มข้นจำเป็นต้องครอบคลุมความเข้มข้นของยาในเลือดที่มีประสิทธิภาพในมนุษย์และความเข้มข้นสูงสุดได้รับเลือกให้มีขนาดอย่างน้อยหนึ่งขนาดสูงกว่าความเข้มข้นของยาในเลือดที่มีประสิทธิภาพโดยเฉลี่ยในมนุษย์ หากความสามารถในการละลายในเฟสน้ำไม่ดีสามารถเลือกตัวทำละลายอินทรีย์เป็นตัวทำละลายได้เช่น DMSO แต่ปริมาณของตัวทำละลายอินทรีย์ที่เพิ่มเข้ามาในระบบจะต้องมีการควบคุม
Q： ในการศึกษาเสถียรภาพการเผาผลาญจำเป็นต้องใช้ระบบทดสอบสองระบบไมโครโซมตับและเซลล์ตับปฐมภูมิสำหรับการทดสอบหรือไม่?
A： ตับ microsomes เป็นเมมเบรนทรงกลมเกือบจะเป็นเช่นโครงสร้างที่เกิดขึ้นจากตัวเอง - ฟิวชั่นของ endoplasmic reticulum ที่แยกส่วนที่ได้รับในระหว่างการ homogenisation และการหมุนเหวี่ยงของเนื้อเยื่อตับและมีเอนไซม์ CYP450 เซลล์ตับปฐมภูมิ (PHCs) เป็นเซลล์ตับที่ได้รับการเพาะเลี้ยงทันทีหลังจากแยกตัวออกจากตับสัตว์โดยตรงซึ่งโดยทั่วไปจะรักษาฟังก์ชั่นการเผาผลาญของตับโดยเฉพาะอย่างยิ่งการรักษาระดับเอนไซม์ที่สอดคล้องกับในร่างกาย ในการศึกษาเสถียรภาพการเผาผลาญไม่จำเป็นต้องพิจารณาค่าใช้จ่ายและสามารถเลือกระบบทดสอบสองระบบสำหรับการทดสอบในเวลาเดียวกัน หรือระบบทดสอบที่เหมาะสมสามารถเลือกได้ตามคุณสมบัติการเผาผลาญของสารประกอบและหลักการคือระบบที่มีการเลือกระบบการเผาผลาญสูง โดยทั่วไปแล้ว microsomes ตับเป็นตัวเลือกที่ดีที่สุดเมื่อโมเลกุลผสมมีน้ำมากขึ้น - ละลายได้และการเผาผลาญเฟสหนึ่งครั้งเป็นเส้นทางการเผาผลาญหลัก (โดยเฉพาะผ่าน CYP); เมื่อการเผาผลาญเฟสสองครั้งเป็นเส้นทางหลักการไฮโดรไลซิสเป็นเส้นทางการเผาผลาญหลักที่ไม่ใช่โปรตีนที่ไม่เฉพาะเจาะจงในไมโครโซมตับสูงมากและการเผาผลาญไม่ชัดเจนใน microsomes ตับการทดสอบสามารถดำเนินการโดยใช้เซลล์ตับหลัก
Q： ความเข้มข้นของ microsomes ตรวจสอบในการทดสอบความเสถียรของการเผาผลาญหรือไม่? ผลกระทบที่สูงเกินไปหรือต่ำเกินไปคืออะไร?
A： ในการทดสอบความเสถียรของการเผาผลาญความเข้มข้นของโปรตีนจะส่งผลต่ออัตราการเผาผลาญมักจะเลือกความเข้มข้นของโปรตีน microsomal 0.1 mg/ml ~ 1 mg/ml ซึ่งเป็นทางเลือกเฉพาะของความเข้มข้นของโปรตีนที่ควรเลือกตามคุณสมบัติการเผาผลาญของสารประกอบของตัวเอง ความเข้มข้นของโปรตีน microsomal สูงเกินไปจะนำไปสู่การไม่ผูกพันเฉพาะของยากับโปรตีน microsomal; ในขณะที่ความเข้มข้นของโปรตีน microsomal ต่ำเกินไปอาจนำไปสู่การเผาผลาญที่ไม่มีนัยสำคัญของยา