Вылучэнне гепатацытаў: метады, працэдуры і прымяненне

Ключавыя словы: першасныя гепатацыты, вылучэнне гепатацытаў, вылучэнне першасных гепатацытаў чалавека, пратакол выдзялення гепатацытаў, вылучэнне першасных клетак печані чалавека, вылучэнне першасных гепатацытаў мышы, вылучэнне першасных клетак печані мышы

Прадукты IPHASE

Кампаненты камплекта:

Уводзіны

Першасны Гепатацытаўз'яўляюцца асноўнымі паренхиматозными клеткамі печані і гуляюць цэнтральную ролю ў метабалізме лекаў, детоксікаціі, сінтэзе бялку і розных фізіялагічных працэсах. Іх вылучэнне з тканіны печані жывёл або чалавека мае вырашальнае значэнне для даследаванняў in vitro ў галіне фармакалогіі, таксікалогіі і даследаванняў захворванняў печані. На працягу дзесяцігоддзяў,вылучэнне гепатацытаўметады былі ўдасканалены для павышэння выхаду, чысціні і жыццяздольнасці клетак, прычым двухэтапны метад перфузіі калагеназы з'яўляецца залатым стандартам.

Метады вылучэння гепатацытаў

Двухэтапны метад калагеназнай перфузіі (метад Сеглена)

Theдвухступеністы метад калагеназнай перфузііз'яўляецца залатым стандартам для вылучэння жыццяздольных першасных гепатацытаў з тканіны печані, і ён шырока ўжываецца з моманту яго ўвядзення Бэры і Фрэндам у 1969 годзе і далейшага ўдасканалення Сегленам. У адрозненне ад простай механічнай дысацыяцыі, якая стварае нізкі выхад пашкоджаных клетак, метад перфузіі выкарыстоўвае старанна кантраляванае ферментатыўнае пераварванне для вызвалення гепатацытаў, захоўваючы пры гэтым іх структуру і функцыю. Гэтую працэдуру часцей за ўсё праводзяць на грызунах, але яе можна прыстасаваць для больш буйных жывёл і нават для тканіны печані чалавека, атрыманай з рэзекцыі або донараў.

Набор для першаснай ізаляцыі гепатацытаў уключае наступныя кампаненты: калагеназу, раствор для перфузіі, раствор для спынення стрававання, дабаўкі да раствора для падзелу, фільтр 0,22 мкм, стэрыльныя шпрыцы і стэрыльную марлю.

Працэс пачынаецца з падрыхтоўкі жывёлы і печані. Суб'ект знаходзіцца пад наркозам, каб мінімізаваць стрэс і забяспечыць належнае абыходжанне падчас аперацыі. Пасля адкрыцця жывата варотную вену выкрываюць і канюлююць, каб усталяваць прамы доступ да кровазвароту печані. Праз гэтую канюлю можна ў кантраляванай паслядоўнасці ўводзіць буферы і ферменты для прамывання і пераварвання тканін.

На першым этапе печань перфузируется цёплым буферам без кальцыя, часта мадыфікаванай версіяй збалансаванага солевага раствора Хэнка. Гэтая пачатковая перфузия выконвае дзве важныя функцыі. Ён выдаляе кроў з сасудзістай сеткі печані, што ачышчае тканіну ад эрытрацытаў, якія ў адваротным выпадку забруджвалі б завісь гепатацытаў. У той жа час асяроддзе, свабоднае ад кальцыя, аслабляе міжклеткавыя злучэнні шляхам хелатирования двухвалентных катыёнаў, паслаблення клетачнай адгезіі і падрыхтоўкі тканіны да ферментатыўнага пераварвання. Печань паступова становіцца бледнай, калі кроў выцясняецца буферам, і гэта змяненне колеру служыць візуальным паказчыкам паспяховай перфузии.

Пасля таго, як печань ачышчана, перфузия пераключаецца на другі раствор, які змяшчае коллагеназу. Коллагеназа - гэта фермент, які расшчапляе вавёркі пазаклеткавага матрікса, у прыватнасці калаген, які забяспечвае структурную цэласнасць тканіны печані. Кальцый дадаецца назад у раствор на гэтай стадыі, таму што ён неабходны для аптымальнай актыўнасці коллагеназы. Перфузію падтрымліваюць пры фізіялагічнай тэмпературы, звычайна каля 37 °C, для падтрымання актыўнасці фермента і захавання жыццяздольнасці клетак. Калі фермент пранікае ў тканіны, печань размягчается і набракае, што сведчыць аб разбурэнні пазаклеткавай каркаса і прагрэсавальным вызваленні гепатацытаў. Неабходна ўважліва сачыць за працягласцю гэтага этапу, паколькі недастатковае пераварванне зніжае выхад клетак, у той час як празмернае пераварванне пашкоджвае клеткі і зніжае жыццяздольнасць.

Пасля ферментатыўнага пераварвання печань вылучаецца з цела і пераносіцца ў стэрыльны посуд, які змяшчае халодны буфер. Тканіна асцярожна раздзіраецца з дапамогай шчыпцоў або лёгкім кручэннем, каб гепатацыты ператварыліся ў завісь. Затым вызваленыя клеткі фільтруюць праз стэрыльную марлю або нейлонавую сетку для выдалення фрагментаў злучальнай тканіны і неперавараных камякоў. Атрыманая клеткавая завісь змяшчае сумесь гепатацытаў, мёртвых клетак і непаренхиматозных клетак.

Для ўзбагачэння жыццяздольнымі гепатацытаў завісь падвяргаюць нізкай хуткасці цэнтрыфугавання. Гепатацыты, будучы больш буйнымі і шчыльнымі, утвараюць асадак, у той час як мёртвыя клеткі і больш дробныя непаренхиматозные клеткі застаюцца ў супернатанте. Паўторныя цыклы прамывання і цэнтрыфугавання паляпшаюць чысціню і ліквідуюць забруджвання. Жыццяздольнасць звычайна ацэньваецца шляхам выключэння трыпанавага сіняга, калі здаровыя гепатацыты выключаюць фарбавальнік, а пашкоджаныя або мёртвыя клеткі прымаюць яго. Паспяховае вылучэнне звычайна дае гепатацытаў з жыццяздольнасцю больш за 85-90%.

Пасля ачысткі гепатацыты можна высаджваць на культуральныя чашкі з калагенавым пакрыццём, дзе яны прымацоўваюцца і распаўсюджваюцца на працягу некалькіх гадзін, аднаўляючы сваю паліганальную марфалогію і ўтвараючы структуры, падобныя на жоўцевыя канальцы. Гэтыя клеткі можна неадкладна выкарыстоўваць для эксперыментаў in vitro або крыякансерваваць для наступнага выкарыстання. Тэхніка крыякансервацыі значна палепшылася, што дазваляе даследчыкам захоўваць вялікія партыі гепатацытаў без істотнай страты метабалічнай функцыі.

Метад двухэтапнай перфузии калагеназы застаецца незаменным у даследаваннях печані, таму што ён забяспечвае высокі выхад метабалічных кампетэнтных гепатацытаў, якія захоўваюць актыўнасць ферментаў метабалізму лекаў, экспрэсію транспарцёраў і іншыя спецыфічныя функцыі печані. Нягледзячы на ​​тое, што гэты метад патрабуе хірургічных навыкаў, дакладнага кантролю ўмоў перфузіі і высокай якасці калагеназы, гэты метад нязменна дае лепшыя вынікі ў параўнанні з альтэрнатыўнымі метадамі. Яго паспяховае прымяненне спрыяла распрацоўцы лекаў, таксікалагічнаму тэсціраванню і рэгенератыўнай медыцыне, што робіць яго адной з найважнейшых працэдур выдзялення клетак у сучасных біямедыцынскіх даследаваннях.

Заключэнне

Першаснае вылучэнне гепатацытаў, асабліва з дапамогай метаду двухступенчатай перфузіі калагеназы, застаецца незаменным метадам у біямедыцынскіх даследаваннях. Атрымліваючы жыццяздольныя, метабалічна кампетэнтныя гепатацыты, гэтая працэдура ляжыць у аснове ключавых дасягненняў у адкрыцці лекаў, таксікалогіі і рэгенератыўнай медыцыне. Пастаяннае ўдасканаленне пратаколаў вылучэння, складаў ферментаў і культуральных сістэм абяцае далейшае павышэнне ўзнаўляльнасці і карыснасці даследаванняў на аснове гепатацытаў.