Isolamento degli epatociti: metodi, procedure e applicazioni

Parole chiave: Epatociti primari, Isolamento degli epatociti, Isolamento di epatociti umani primari, Protocollo di isolamento degli epatociti, Isolamento di cellule epatiche umane primarie, Isolamento di epatociti primari di topo, Isolamento di cellule epatiche primarie di topo

Prodotti IPHASE

Componenti del Kit:

Introduzione

Primario Epatocitisono le principali cellule parenchimali del fegato e svolgono un ruolo centrale nel metabolismo dei farmaci, nella disintossicazione, nella sintesi proteica e in vari processi fisiologici. Il loro isolamento dal tessuto epatico animale o umano è fondamentale per gli studi in vitro nella ricerca farmacologica, tossicologica e sulle malattie epatiche. Nel corso dei decenni,isolamento degli epatocitile tecniche sono state perfezionate per migliorare la resa, la purezza e la vitalità cellulare, con il metodo di perfusione della collagenasi in due fasi che rappresenta il gold standard.

Metodi di isolamento degli epatociti

Metodo di perfusione della collagenasi in due fasi (metodo Seglen)

Ilmetodo di perfusione con collagenasi in due fasiè il gold standard per isolare gli epatociti primari vitali dal tessuto epatico ed è stato ampiamente applicato sin dalla sua introduzione da Berry e Friend nel 1969 e ulteriormente perfezionato da Seglen. A differenza della semplice dissociazione meccanica, che produce una scarsa resa di cellule danneggiate, il metodo di perfusione utilizza una digestione enzimatica attentamente controllata per rilasciare gli epatociti mantenendone la struttura e la funzione. Questa procedura viene comunemente eseguita nei roditori, ma può essere adattata ad animali più grandi e persino al tessuto epatico umano ottenuto da resezioni o donatori.

Il kit di isolamento primario degli epatociti comprende i seguenti componenti: collagenasi, soluzione di perfusione, soluzione di terminazione della digestione, integratori della soluzione di separazione, filtro da 0,22 um, siringhe sterili e garza sterile.

Il processo inizia con la preparazione dell'animale e del fegato. Il soggetto viene anestetizzato per ridurre al minimo lo stress e garantire una corretta gestione durante l'intervento. Una volta aperto l'addome, la vena porta viene esposta e incannulata per stabilire un accesso diretto alla circolazione epatica. Attraverso questa cannula, è possibile introdurre tamponi ed enzimi in una sequenza controllata per lavare e digerire il tessuto.

Nella prima fase, il fegato viene perfuso con un tampone caldo, privo di calcio, spesso una versione modificata della soluzione salina bilanciata di Hank. Questa perfusione iniziale ha due funzioni critiche. Rimuove il sangue dal sistema vascolare epatico, liberando il tessuto dai globuli rossi che altrimenti contaminerebbero la sospensione degli epatociti. Allo stesso tempo, l’ambiente privo di calcio indebolisce le giunzioni intercellulari chelando i cationi bivalenti, allentando l’adesione cellula-cellula e preparando il tessuto per la digestione enzimatica. Il fegato diventa gradualmente pallido man mano che il sangue viene spostato dal tampone e questo cambiamento di colore funge da indicatore visivo di una perfusione riuscita.

Una volta che il fegato è stato ripulito, la perfusione viene passata alla seconda soluzione contenente collagenasi. La collagenasi è un enzima che digerisce le proteine ​​della matrice extracellulare, in particolare il collagene, che fornisce l'integrità strutturale al tessuto epatico. Il calcio viene aggiunto nuovamente alla soluzione in questa fase perché è necessario per un'attività ottimale della collagenasi. La perfusione viene mantenuta a temperatura fisiologica, solitamente intorno ai 37 °C, per mantenere attivo l'enzima e preservare la vitalità cellulare. Quando l’enzima penetra nel tessuto, il fegato si ammorbidisce e si gonfia, indicando la rottura dell’impalcatura extracellulare e il progressivo rilascio di epatociti. La durata di questa fase deve essere attentamente monitorata, poiché la sottodigestione riduce la resa cellulare, mentre la sovradigestione danneggia le cellule e riduce la vitalità.

Dopo la digestione enzimatica, il fegato viene asportato dal corpo e trasferito in un piatto sterile contenente un tampone freddo. Il tessuto viene separato delicatamente utilizzando una pinza o agitandolo delicatamente per disperdere gli epatociti in sospensione. Le cellule rilasciate vengono poi filtrate attraverso una garza sterile o una rete di nylon per rimuovere frammenti di tessuto connettivo e grumi non digeriti. La sospensione cellulare risultante contiene una miscela di epatociti, cellule morte e cellule non -parenchimali.

Per arricchire gli epatociti vitali, la sospensione viene sottoposta a centrifugazione a bassa velocità. Gli epatociti, essendo più grandi e densi, formano un pellet, mentre le cellule morte e le cellule non parenchimali più piccole rimangono nel surnatante. Cicli ripetuti di lavaggio e centrifugazione migliorano la purezza ed eliminano i contaminanti. La vitalità viene generalmente valutata mediante l'esclusione del trypan blue, in cui gli epatociti sani escludono il colorante, mentre le cellule danneggiate o morte lo assorbono. Un isolamento riuscito generalmente produce epatociti con una vitalità superiore all'85-90%.

Una volta purificati, gli epatociti possono essere piastrati su piastre di coltura rivestite di collagene, dove si attaccano e si diffondono in poche ore, riacquistando la loro morfologia poligonale e formando strutture simili a canalicoli biliari. Queste cellule possono essere utilizzate immediatamente per esperimenti in vitro o crioconservate per un uso successivo. Le tecniche di crioconservazione sono migliorate in modo significativo, consentendo ai ricercatori di conservare grandi lotti di epatociti senza una grave perdita della funzione metabolica.

Il metodo di perfusione della collagenasi in due fasi rimane indispensabile nella ricerca sul fegato perché fornisce elevate rese di epatociti metabolicamente competenti che mantengono l'attività enzimatica metabolizzante del farmaco, l'espressione del trasportatore e altre funzioni specifiche del fegato. Sebbene richieda abilità chirurgica, controllo preciso delle condizioni di perfusione e collagenasi di alta qualità, il metodo produce costantemente risultati superiori rispetto alle tecniche alternative. La sua applicazione di successo ha fatto avanzare lo sviluppo di farmaci, i test tossicologici e la medicina rigenerativa, rendendola una delle procedure di isolamento cellulare più importanti nella moderna ricerca biomedica.

Conclusione

L'isolamento primario degli epatociti, in particolare tramite il metodo di perfusione della collagenasi in due fasi, rimane una tecnica indispensabile nella ricerca biomedica. Producendo epatociti vitali e metabolicamente competenti, questa procedura è alla base di progressi chiave nella scoperta di farmaci, nella tossicologia e nella medicina rigenerativa. Il continuo perfezionamento dei protocolli di isolamento, delle formulazioni enzimatiche e dei sistemi di coltura promette di migliorare ulteriormente la riproducibilità e l'utilità degli studi basati sugli epatociti.