Fitokanana hepatocyte: fomba, fomba fiasa ary fampiharana

Keywords: Hepatocytes Kilonga, Isolation Hepatocyte, Isolation of Primary Human Hepatocytes, Hepatocyte Isolation Protocol, Isolation of Primary Human Liver Cells, Isolation of Primary Mouse Hepatocytes, Isolation of Primary Mouse Liver Cells

Ny vokatra IPHASE

Ny singa ao amin'ny Kit:

Fampidirana

Kilonga HepatocytesIzy ireo no sela parenchyma lehibe indrindra amin'ny atiny ary mitana anjara toerana lehibe amin'ny metabolisma zava-mahadomelina, detoxification, synthesis proteinina ary dingana ara-batana isan-karazany. Ny fitokanan'izy ireo amin'ny vatan'ny biby na ny olombelona dia tena ilaina amin'ny fandalinana in vitro amin'ny pharmacology, toxicology, ary fikarohana aretin'ny atiny. Nandritra ny am-polony taona maro,fitokana-monina hepatocyteNy teknika dia nodiovina mba hanatsarana ny vokatra azo avy amin'ny sela, ny fahadiovana ary ny fahavelomana, miaraka amin'ny fomba roa - dingana collagenase perfusion no fenitra volamena.

Fomba fisarahana hepatocyte

Two-Step Collagenase Perfusion Method (Seglen method)

Nyfomba roa-dingana collagenase perfusionno fenitry ny volamena amin'ny fitokanana ny hepatocytes fototra mahavelona amin'ny tavy aty, ary efa nampiharina be hatramin'ny nampidiran'i Berry sy Friend tamin'ny taona 1969 ary nodiovin'i Seglen. Tsy toy ny fisarahana ara-mekanika tsotra, izay miteraka vokatra ratsy amin'ny sela simba, ny fomba perfusion dia mampiasa ny fandevonan-kanina enzymatic voafehy tsara mba hamoahana ny hepatocytes sady mitazona ny rafitra sy ny asany. Io fomba fanao io dia matetika atao amin'ny biby mpikiky, saingy azo ampifanarahana amin'ny biby lehibe kokoa ary eny fa na dia ho an'ny vatan'olombelona azo avy amin'ny resection na mpanome.

Ny Kit Isolation Hepatocytes Kilonga dia ahitana singa manaraka ireto: collagenase, vahaolana perfusion, vahaolana famaranana ny fandevonan-kanina, fanampim-panasarahana vahaolana, sivana 0.22um, syringe sterile ary gauze sterile.

Ny dingana dia manomboka amin'ny fanomanana ny biby sy ny atiny. Atao anesthétika ilay lohahevitra mba hampihenana ny adin-tsaina sy hiantohana ny fikarakarana tsara mandritra ny fandidiana. Raha vantany vao misokatra ny kibo, dia miharihary ny lalan-dràn'ny vavahadin'ny vavahady ary atao cannulate mba hametrahana fidirana mivantana amin'ny fikorianan'ny atiny. Amin'ny alalan'ity cannula ity, ny buffers sy ny enzymes dia azo ampidirina amin'ny filaharana voafehy mba hanadio sy handevona ny tavy.

Amin'ny dingana voalohany, ny atiny dia manitra miaraka amin'ny buffer mafana, calcium-maimaim-poana, matetika dikan-teny novaina amin'ny Hank's Balanced Salt Solution. Ity perfusion voalohany ity dia manana andraikitra roa lehibe. Manala ny ra amin'ny vasculature hepatika izy io, izay manadio ny sela mena izay mety handoto ny fampiatoana ny hepatocyte. Mandritra izany fotoana izany, ny kalsioma - tontolo maimaim-poana dia mampihena ny fihaonan'ny intercellular amin'ny alàlan'ny chelating cation divalent, mamaha ny fidiran'ny sela-sela ary manomana ny tavy ho an'ny fandevonan-kanina enzymatic. Lasa hatsatra tsikelikely ny aty rehefa afindran'ny buffer ny ra, ary io fiovan'ny loko io no famantarana hita maso ny fampidiran-dra mahomby.

Rehefa voadio ny aty, dia afindra amin'ny vahaolana faharoa misy collagenase ny perfusion. Collagenase dia anzima izay mandevona proteinina matrix extracellular, indrindra fa ny collagen, izay manome ny tsy fivadihana ara-drafitra amin'ny atiny. Ny kalsioma dia ampiana indray amin'ny vahaolana amin'ity dingana ity satria ilaina amin'ny hetsika collagenase tsara indrindra. Ny perfusion dia tazonina amin'ny mari-pana ara-batana, matetika eo amin'ny 37 ° C, mba hitazonana ny enzyme ho mavitrika sy hitazonana ny fahafahan'ny sela. Rehefa miditra ao amin'ny tavy ny enzyme, dia mihamalemy sy mivonto ny aty, izay manondro ny fahapotehan'ny scaffolding extracellular sy ny famoahana tsikelikely ny hepatocytes. Ny faharetan'ity dingana ity dia tsy maintsy araha-maso tsara, satria ny fandevonan-kanina dia mampihena ny vokatra azo avy amin'ny sela, fa ny fandevonan-kanina dia manimba ny sela ary mampihena ny fahafaha-miaina.

Aorian'ny fandevonan-kanina enzymatic dia esorina amin'ny vatana ny aty ary afindra ao anaty vilia sterile misy buffer mangatsiaka. Esorina moramora amin'ny alalan'ny forceps na amin'ny fanodinkodinana malefaka ny tavy mba hanaparitahana ny hepatocytes ho mihantona. Ny sela navoaka avy eo dia voasivana amin'ny alalan'ny gauze sterile na nylon mesh mba hanesorana ireo potipotin'ny tavy mifandray sy ny fivontosana tsy levona. Ny fampiatoana sela vokatr'izany dia misy fifangaroan'ny hepatocytes, ny sela maty ary ny sela tsy parenchymal.

Mba hampanankarena ho an'ny hepatocytes velona, ​​ny fampiatoana dia iharan'ny centrifugation ambany. Ny hepatocytes, izay lehibe kokoa sy matevina, dia mamorona pellet, fa ny sela maty sy ny sela tsy misy parenchyma kely dia mijanona ao amin'ny supernatant. Manatsara ny fahadiovana sy manala ny loto ny tsingerina fanasan-damba miverimberina sy centrifugation. Amin'ny ankapobeny dia tombanana amin'ny alàlan'ny fanilihana manga trypan ny fahavelomana, izay tsy ahitana ny loko ny hepatocytes salama, raha ny sela simba na maty kosa no maka azy. Ny fitokana-monina mahomby amin'ny ankapobeny dia miteraka hepatocytes manana mihoatra ny 85-90% viability.

Rehefa voadio ny hepatocytes dia azo apetaka eo amin'ny collagène - lovia kolontsaina mifono vy, izay mipetaka sy miparitaka ao anatin'ny ora maro, miverina amin'ny endriny polygonal ary mamorona rafitra toy ny canaliculi - Ireo sela ireo dia azo ampiasaina avy hatrany amin'ny fanandramana in vitro na cryopreserve ho an'ny fampiasana aoriana. Nihatsara be ny teknikan'ny cryopreservation, ahafahan'ny mpikaroka mitahiry ampahany betsaka amin'ny hepatocytes tsy misy fatiantoka lehibe amin'ny fiasan'ny metabolika.

Ny fomba fandrahoan-tsakafo roa - dingana collagenase dia mijanona ho tena ilaina amin'ny fikarohana aty satria manome vokatra be dia be amin'ny hepatocytes mahay metabolika izay mitazona zava-mahadomelina - metabolizing enzyme, fanehoana transporter, ary atiny hafa - asa manokana. Na dia mitaky fahaiza-manao fandidiana aza izany, fanaraha-maso tsara ny toetry ny perfusion, ary collagenase avo lenta, ny fomba dia mamokatra vokatra tsara kokoa raha oharina amin'ny teknika hafa. Ny fampiharana mahomby azy dia manana fivoarana zava-mahadomelina mandroso, fitsapana misy poizina ary fanafody fanavaozana, ka mahatonga azy io ho iray amin'ireo fomba fiasa mitoka-monina manan-danja indrindra amin'ny fikarohana biomedical maoderina.

Fehiny

Ny fitokana-monina Hepatocyte Kilonga, indrindra amin'ny alalan'ny fomba roa-step collagenase perfusion, dia mbola teknika tena ilaina amin'ny fikarohana biomedical. Amin'ny famokarana hepatocytes mahavelona sy mahay amin'ny metabolika, ity fomba fiasa ity dia manohana ny fandrosoana lehibe amin'ny fikarohana zava-mahadomelina, ny toxôlôjia ary ny fitsaboana fanavaozana. Ny fanatsarana tsy tapaka amin'ny protocols mitoka-monina, ny fandrafetana anzima, ary ny rafitra kolontsaina dia mampanantena fa hanatsara bebe kokoa ny famerenana sy ny fampiasana ny hepatocyte - fandalinana mifototra.