การแยกเซลล์ตับ: วิธีการ ขั้นตอน และการประยุกต์

คำสำคัญ: เซลล์ตับปฐมภูมิ, การแยกเซลล์ตับ, การแยกเซลล์ตับปฐมภูมิของมนุษย์, โปรโตคอลการแยกเซลล์ตับปฐมภูมิ, การแยกเซลล์ตับปฐมภูมิของมนุษย์, การแยกเซลล์ตับปฐมภูมิของหนูเมาส์, การแยกเซลล์ตับปฐมภูมิของหนูเมาส์

ผลิตภัณฑ์ไอเฟส

ส่วนประกอบของชุด:

บทนำ

ประถมศึกษา เซลล์ตับเป็นเซลล์เนื้อเยื่อหลักของตับและมีบทบาทสำคัญในการเผาผลาญยา การล้างพิษ การสังเคราะห์โปรตีน และกระบวนการทางสรีรวิทยาต่างๆ การแยกพวกมันออกจากเนื้อเยื่อตับของสัตว์หรือมนุษย์เป็นสิ่งสำคัญสำหรับการศึกษานอกร่างกายในด้านเภสัชวิทยา พิษวิทยา และการวิจัยโรคตับ ตลอดหลายทศวรรษที่ผ่านมาการแยกเซลล์ตับเทคนิคต่างๆ ได้รับการปรับปรุงเพื่อเพิ่มผลผลิตของเซลล์ ความบริสุทธิ์ และความมีชีวิต โดยวิธีการกระจายคอลลาเจนเนสแบบสองขั้นตอนถือเป็นมาตรฐานทองคำ

วิธีการแยกเซลล์ตับ

วิธีเติมคอลลาเจนเนสแบบสองขั้นตอน (วิธี Seglen)

ที่สองขั้นตอนวิธีการกระจายคอลลาเจนเนสเป็นมาตรฐานทองคำสำหรับการแยกเซลล์ตับปฐมภูมิที่มีชีวิตออกจากเนื้อเยื่อตับ และมีการใช้กันอย่างแพร่หลายนับตั้งแต่ Berry และ Friend เปิดตัวในปี 1969 และปรับปรุงเพิ่มเติมโดย Seglen ซึ่งแตกต่างจากการแยกตัวทางกลแบบธรรมดาซึ่งสร้างผลผลิตที่ไม่ดีของเซลล์ที่เสียหาย วิธีการกระจายจะใช้การย่อยด้วยเอนไซม์ที่มีการควบคุมอย่างระมัดระวังเพื่อปล่อยเซลล์ตับในขณะที่ยังคงรักษาโครงสร้างและการทำงานของเซลล์ไว้ ขั้นตอนนี้มักใช้กับสัตว์ฟันแทะ แต่สามารถนำไปใช้กับสัตว์ขนาดใหญ่ หรือแม้แต่เนื้อเยื่อตับของมนุษย์ที่ได้รับจากการผ่าตัดหรือจากผู้บริจาคก็ได้

ชุดแยกเซลล์ตับปฐมภูมิประกอบด้วยส่วนประกอบต่อไปนี้: คอลลาเจนเนส สารละลายกำซาบ สารละลายยุติการย่อยอาหาร อาหารเสริมสารละลายแยก ตัวกรอง 0.22um กระบอกฉีดฆ่าเชื้อ และผ้ากอซปลอดเชื้อ

กระบวนการเริ่มต้นด้วยการเตรียมสัตว์และตับ ผู้เข้ารับการทดสอบได้รับการดมยาสลบเพื่อลดความเครียดและให้แน่ใจว่าได้รับการดูแลอย่างเหมาะสมระหว่างการผ่าตัด เมื่อช่องท้องถูกเปิดออก หลอดเลือดดำพอร์ทัลจะถูกเปิดออกและสอดเข้าไปในท่อเพื่อสร้างการเข้าถึงการไหลเวียนของตับโดยตรง โดยผ่านท่อแคนนูลานี้ บัฟเฟอร์และเอ็นไซม์สามารถถูกป้อนตามลำดับที่มีการควบคุมเพื่อล้างและย่อยเนื้อเยื่อ

ในระยะแรก ตับจะเต็มไปด้วยบัฟเฟอร์อุ่นที่ปราศจากแคลเซียม ซึ่งมักจะเป็นเวอร์ชันดัดแปลงของ Hank’s Balanced Salt Solution การกำซาบเริ่มแรกนี้มีหน้าที่สำคัญสองประการ โดยจะกำจัดเลือดออกจากหลอดเลือดในตับ ซึ่งจะล้างเนื้อเยื่อของเซลล์เม็ดเลือดแดงที่อาจปนเปื้อนสารแขวนลอยของเซลล์ตับ ในเวลาเดียวกัน สภาพแวดล้อมที่ปราศจากแคลเซียมจะทำให้จุดเชื่อมต่อระหว่างเซลล์อ่อนลงโดยการคีเลตไดวาเลนต์แคตไอออน ลดการยึดเกาะระหว่างเซลล์และเซลล์ และเตรียมเนื้อเยื่อสำหรับการย่อยด้วยเอนไซม์ ตับจะค่อยๆ ซีดลงเมื่อเลือดถูกแทนที่โดยบัฟเฟอร์ และการเปลี่ยนสีนี้ทำหน้าที่เป็นตัวบ่งชี้ที่มองเห็นได้ของการไหลเวียนโลหิตที่ประสบความสำเร็จ

เมื่อตับสะอาดแล้ว การกำซาบจะเปลี่ยนไปใช้สารละลายที่สองที่มีคอลลาเจนเนส คอลลาเจนเนสเป็นเอนไซม์ที่ย่อยโปรตีนเมทริกซ์นอกเซลล์ โดยเฉพาะคอลลาเจน ซึ่งให้ความสมบูรณ์ทางโครงสร้างของเนื้อเยื่อตับ แคลเซียมจะถูกเติมกลับเข้าไปในสารละลายในขั้นตอนนี้ เนื่องจากจำเป็นสำหรับการทำงานของคอลลาเจนเนสที่เหมาะสมที่สุด การกำซาบจะถูกรักษาไว้ที่อุณหภูมิทางสรีรวิทยา โดยปกติจะอยู่ที่ประมาณ 37 °C เพื่อให้เอนไซม์ทำงานและรักษาความมีชีวิตของเซลล์ เมื่อเอนไซม์แทรกซึมเข้าไปในเนื้อเยื่อ ตับจะนิ่มและพองขึ้น ซึ่งบ่งชี้ถึงการสลายของโครงร่างนอกเซลล์และการปลดปล่อยของเซลล์ตับอย่างต่อเนื่อง ต้องติดตามระยะเวลาของขั้นตอนนี้อย่างระมัดระวัง เนื่องจากการย่อยน้อยจะทำให้ผลผลิตของเซลล์ลดลง ในขณะที่การย่อยมากเกินไปจะทำลายเซลล์และลดความมีชีวิตลง

หลังจากการย่อยด้วยเอนไซม์ ตับจะถูกตัดออกจากร่างกายและถ่ายโอนไปยังจานปลอดเชื้อที่มีบัฟเฟอร์เย็น เนื้อเยื่อจะถูกแยกออกจากกันโดยใช้คีมหรือโดยการหมุนวนเบาๆ เพื่อกระจายเซลล์ตับให้กลายเป็นสารแขวนลอย จากนั้นเซลล์ที่ปล่อยออกมาจะถูกกรองผ่านผ้ากอซหรือตาข่ายไนลอนที่ปลอดเชื้อเพื่อกำจัดเศษเนื้อเยื่อเกี่ยวพันและก้อนที่ไม่ได้แยกแยะออก สารแขวนลอยของเซลล์ที่เกิดขึ้นนั้นมีส่วนผสมของเซลล์ตับ เซลล์ที่ตายแล้ว และเซลล์ที่ไม่ใช่พาเรนไคม์

เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพให้กับเซลล์ตับที่มีชีวิต สารแขวนลอยต้องผ่านการหมุนเหวี่ยงด้วยความเร็วต่ำ เซลล์ตับมีขนาดใหญ่กว่าและหนาแน่นกว่า ก่อตัวเป็นเม็ด ในขณะที่เซลล์ที่ตายแล้วและเซลล์ที่ไม่ใช่เนื้อเยื่อขนาดเล็กยังคงอยู่ในส่วนเหนือตะกอน รอบการล้างและการหมุนเหวี่ยงซ้ำๆ ช่วยเพิ่มความบริสุทธิ์และกำจัดสิ่งปนเปื้อน โดยทั่วไปความมีชีวิตจะถูกประเมินโดยการยกเว้นทริแพนบลู โดยที่เซลล์ตับที่มีสุขภาพดีจะแยกสีย้อมออก ในขณะที่เซลล์ที่เสียหายหรือเซลล์ที่ตายแล้วจะดูดซับสีย้อมนั้น การแยกตัวที่ประสบความสำเร็จโดยทั่วไปจะทำให้เซลล์ตับมีความมีชีวิตมากกว่า 85–90%

เมื่อทำให้บริสุทธิ์แล้ว เซลล์ตับสามารถนำไปชุบบนจานเพาะเลี้ยงที่เคลือบคอลลาเจน โดยที่เซลล์เหล่านี้จะเกาะติดและแพร่กระจายภายในไม่กี่ชั่วโมง ทำให้ได้สัณฐานวิทยาเป็นรูปหลายเหลี่ยมกลับคืนมา และสร้างโครงสร้างคล้ายท่อน้ำดี เซลล์เหล่านี้สามารถนำมาใช้ได้ทันทีสำหรับการทดลองในหลอดทดลองหรือเก็บรักษาด้วยความเย็นเพื่อใช้ในภายหลัง เทคนิคการเก็บรักษาด้วยการแช่แข็งได้รับการปรับปรุงให้ดีขึ้นอย่างมาก ช่วยให้นักวิจัยสามารถจัดเก็บเซลล์ตับจำนวนมากได้โดยไม่สูญเสียการทำงานของระบบเมตาบอลิซึมมากนัก

วิธีการกระจายคอลลาเจนเนสแบบสองขั้นตอนยังคงขาดไม่ได้ในการวิจัยเกี่ยวกับตับ เนื่องจากวิธีนี้ให้ผลตอบแทนสูงของเซลล์ตับที่มีความสามารถในการเผาผลาญ โดยยังคงรักษาการทำงานของเอนไซม์ในการเผาผลาญของยา การแสดงออกของตัวขนส่ง และการทำงานเฉพาะอื่นๆ ของตับ แม้ว่าจะต้องอาศัยทักษะในการผ่าตัด การควบคุมสภาวะการกำซาบอย่างแม่นยำ และคอลลาเจนเนสคุณภาพสูง แต่วิธีการนี้ให้ผลลัพธ์ที่เหนือกว่าอย่างสม่ำเสมอเมื่อเทียบกับเทคนิคทางเลือก การใช้งานที่ประสบความสำเร็จมีการพัฒนายาขั้นสูง การทดสอบทางพิษวิทยา และเวชศาสตร์ฟื้นฟู ซึ่งทำให้เป็นหนึ่งในกระบวนการแยกเซลล์ที่สำคัญที่สุดในการวิจัยทางชีวการแพทย์สมัยใหม่

บทสรุป

การแยกเซลล์ตับปฐมภูมิ โดยเฉพาะอย่างยิ่งผ่านวิธีการกระจายคอลลาเจนเนสสองขั้นตอน ยังคงเป็นเทคนิคที่ขาดไม่ได้ในการวิจัยทางชีวการแพทย์ กระบวนการนี้สนับสนุนความก้าวหน้าที่สำคัญในการค้นคว้ายา พิษวิทยา และเวชศาสตร์ฟื้นฟู โดยให้เซลล์ตับที่มีความสามารถในการเผาผลาญและทำงานได้ การปรับปรุงอย่างต่อเนื่องในโปรโตคอลการแยก สูตรเอนไซม์ และระบบการเพาะเลี้ยงสัญญาว่าจะเพิ่มความสามารถในการทำซ้ำและประโยชน์ของการศึกษาเกี่ยวกับเซลล์ตับ