Ключови думи:Органоид, 3D култивиране, 3D сфероидна култура, 3D клетъчна култура, първични хепатоцити, първични човешки хепатоцити, първични маймунски хепатоцити, първични кучешки хепатоцити, първични хепатоцити на плъхове, първични миши хепатоцити, ултра-слабо прикрепена културална плака

Продукти IPHASE

Въведение

Бързото развитие на технологиите Organoid и 3D клетъчни култури трансформира предклиничните изследвания. Тъй като фармацевтичните компании се стремят към повече предсказуемоствитро модОсвен това традиционната двуизмерна (2D) клетъчна култура все повече се заменя от физиологично релевантни 3D системи за култивиране.

Важен крайъгълен камък дойде през април 2025 г., когато FDA на САЩ обяви планове за намаляване на изискванията за изпитване върху животни за оценка на безопасността на моноклоналните антитела, докато encoнасърчаване на приемането на методологиите на нов подход (NAM), включително органоиди и усъвършенствани модели, базирани на човешки клетки. Тази промяна в политиката подчертава нарастващото значение на ин витро системите, свързани с човека, за разработването на лекарства.

Сред тези технологии първичната хепатоцитна 3D сфероидна култура се превърна в един от най-практичните и широко възприети чернодробни модели. Като позволяват на първичните хепатоцити да се сглобяват в триизмерни сфероиди, изследователите могат да запазят чернодробните специфични функции за продължителни периоди, като същевременно постигат повече прогнозни данни за метаболизма на лекарствата, хепатотоксичността и изследването на чернодробни заболявания.

Какво представляват чернодробните органоиди и хепатоцитните сфероиди?

Органоидите са триизмерни многоклетъчни структури, получени от стволови клетки, които рекапитулират ключови архитектурни и функционални характеристики на местните органи. Чернодробните органоиди демонстрират огромен потенциал в регенеративната медицина, моделирането на заболявания и персонализираните терапии.

В сравнение с органоидите, получени от стволови клетки, първичните хепатоцитни сфероиди представляват по-проста и силно възпроизводима форма на 3D сфероидна култура. Вместо да изискват сложни извънклетъчни матрици или протоколи за диференциация, прясно изолирани първични хепатоцити спонтанно се агрегират при ултра-ниски условия на прикрепване, за да образуват компактни многоклетъчни сфероиди, като същевременно поддържат основните чернодробни фенотипове.

Този директен подход направи сфероидите на хепатоцитите един от най-широко използваните чернодробни модели за фармацевтични изследвания.

Защо 3D културата превъзхожда конвенционалната 2D култура

Първичните хепатоцити бързо губят своя диференциран фенотип, когато се култивират като конвенционални монослоеве. Само в рамките на няколко дни много чернодробни-специфични функции намаляват драстично, включително: активността на ензима на цитохром P450、секрецията на албумин、метаболизма на жлъчните киселини、експресията на лекарствения транспортер、клетъчната полярност. Тези ограничения намаляват прогностичната стойност на традиционните 2D култури за дългосрочни изследвания на токсичността.

За разлика от това, 3D сфероидната култура пресъздава критични клетъчни-клетъчни взаимодействия и архитектура на микросредата, открита в естествената чернодробна тъкан. Получените сфероиди показват подобрена физиологична значимост чрез подобрена клетъчна комуникация, кислородни градиенти, дифузия на хранителни вещества и поддържане на чернодробна поляризация.

Следователно първичните хепатоцитни сфероиди поддържат стабилни функции на черния дроб седмици, а не дни, което ги прави особено ценни за проучвания за хронична експозиция на лекарства.

Предимства на първичната хепатоцитна 3D сфероидна култура

1. Дългосрочна функционална стабилност

Ключово предимство на 3D първичната хепатоцитна сфероидна култура е дългосрочното запазване на чернодробните специфични функции. Чрез насърчаване на обширни клетъчни взаимодействия и пресъздаване на по-физиологично подходяща микросреда, сфероидите запазват критични чернодробни характеристики, които бързо се губят в конвенционалните 2D култури. При оптимизирани условия първичните хепатоцитни сфероиди поддържат стабилно производство на албумин, ензимна активност на CYP450, метаболизъм във фаза I и фаза II и експресия на лекарствения транспортер за повече от 21 дни. Този удължен функционален живот позволява по-предсказуеми in vitro модели за метаболизма на лекарствата, оценка на хепатотоксичността и изследване на хронични чернодробни заболявания.

2. Подобрено физиологично значение

Едно от основните предимства на 3D хепатоцитна сфероидна култура е нейната способност да пресъздава ключови характеристики на естествената чернодробна микросреда. Чрез екстензивни клетъчни -клетъчни взаимодействия и образуване на тъканна-подобна-триизмерна архитектура, сфероидите установяват физиологично значими градиенти на кислород и хранителни вещества, като същевременно запазват чернодробната полярност и клетъчната функция. В резултат на това първичните хепатоцити проявяват метаболитни активности, които наподобяват повече тези, наблюдавани in vivo, което води до подобрено предсказване на лекарствения метаболизъм, чернодробната функция и медикаментозно индуцирано чернодробно увреждане (DILI) в сравнение с конвенционалните 2D монослойни култури.

3. Приложения при откриване на лекарства и изследване на черния дроб

Повишената физиологична значимост и дългосрочната функционална стабилност на първичните хепатоцитни сфероиди са ги направили ценни инструменти в широк спектър от приложения за биомедицински изследвания. Те се използват широко в лекарствения метаболизъм и фармакокинетичните изследвания, оценката на хепатотоксичността, прогнозирането на DILI, анализите за индукция и инхибиране на CYP и тестовете за метаболитна стабилност. В допълнение, хепатоцитните сфероиди осигуряват стабилни in vitro модели за изследване на чернодробни заболявания, включително неалкохолен стеатохепатит (NASH), чернодробна фиброза и вирусен хепатит. Тяхната способност да обобщават по-добре естествената чернодробна физиология също ги прави изключително подходящи за прецизна медицина, регенеративна медицина и други усъвършенствани транслационни изследователски приложения.

Изграждане на надеждни 3D хепатоцитни сфероиди

Успешната 3D сфероидна култура зависи от три основни компонента:

1. Високо-качествени първични хепатоцити

Качеството на клетките директно определя сфероидната морфология, жизнеспособността и дългосрочната функция.

IPHASE осигурява високо-жизнеспособни криоконсервирани първични хепатоцити от множество видове, включително:

• Първични човешки хепатоцити
• Първични маймунски хепатоцити
• Първични кучешки хепатоцити
• Първични хепатоцити на плъх
• Първични миши хепатоцити

Всички хепатоцити се подлагат на строг контрол на качеството, за да се гарантира висока жизнеспособност, постоянна производителност и възпроизводимост от партида към партида.

2. Оптимизирана 3D културална медия

Специализираните среди са от съществено значение както за образуването на сфероиди, така и за дългосрочната поддръжка.

Работният процес IPHASE включва:

• Среда за размразяване на хепатоцити
• Среда за 3D сфероидно образуване на хепатоцити
• Хепатоцитна 3D сфероидна поддържаща среда

Тези среди поддържат ефективно агрегиране, като същевременно запазват чернодробната функция през продължителни периоди на култивиране.

3. Плаки за култура с ултра-ниско прикрепване

Надеждното образуване на сфероид изисква съдове за култура, които предотвратяват клетъчната адхезия.

IPHASE Ultra-Low Attachment Plates Culture Plates позволява на хепатоцитите да се сами-сглобяват в еднакви сфероиди, без да изискват покрития на извънклетъчната матрица, осигурявайки отлична консистенция за рутинни лабораторни работни процеси.

Експериментално валидиране

Използвайки първични хепатоцити на маймуна cynomolgus, IPHASE успешно създаде стабилни 3D чернодробни сфероиди в рамките на седем дни, използвайки своята оптимизирана система за култура(Фигура 1 и 2).

Фигура 1. Представителни 3D сфероиди, генерирани от IPHASE Първични хепатоцити на маймуна Cynomolgus (Партида K0125E069).

Фигура 2. Представителни 3D сфероиди, генерирани от IPHASE Първични хепатоцити на маймуна Cynomolgus (Партида K0124E022).

За по-нататъшно валидиране на работата на IPHASE 3D първична хепатоцитна сфероидна културална система, първични хепатоцити от множество видове бяха култивирани с помощта на същия стандартизиран работен процес, включително маймуна циномолгус (партида K0125E086), куче бигъл (партида B0125H018) и хепатоцити на плъх Sprague-Dawley. Секрецията на албумин в супернатантата на културата се измерва след 7 дни на сфероидна култура като функционален индикатор за чернодробна активност (Фигура 1). И трите вида успешно формираха стабилни сфероиди и поддържаха откриваемо производство на албумин, демонстрирайки здравината и възпроизводимостта на IPHASE 3D културалната платформа в различни животински модели.

За да се оцени дългосрочната функционална стабилност на сфероидите, хепатоцитите на маймуна Cynomolgus (Партида K0124E022) се култивират до 21 дни. Секрецията на албумин се оценява в множество времеви точки през целия период на култура (Фигура 2). Продължителното производство на албумин по време на дългосрочно култивиране показва, че сфероидната система IPHASE 3D ефективно запазва специфичните за черния дроб функции, подкрепяйки приложението му в проучвания за хронична токсичност, метаболизъм на лекарства и дългосрочно моделиране на чернодробно заболяване.

Фигура 1. Секреция на албумин от 3D сфероиди, генерирани от първични хепатоцити от различни видове след 7 дни култура.
Фигура 2. Секреция на албумин от първични хепатоцитни сфероиди на маймуна cynomolgus, култивирани за 7 и 21 дни.
IPHASE Цялостно решение за 3D чернодробни модели

За да подкрепи нарастващото търсене на усъвършенствани 3D клетъчни култури и изследвания на Organoid, IPHASE осигурява интегриран работен процес за хепатоцитна сфероидна култура, включително:

• Криоконсервирани първични човешки хепатоцити
• Първични маймунски хепатоцити
• Първични кучешки хепатоцити
• Първични хепатоцити на плъх
• Първични миши хепатоцити
• Среда за размразяване на хепатоцити
• Среда за 3D сфероидно образуване на хепатоцити
• Хепатоцитна 3D сфероидна поддържаща среда
• Плаки за култура с ултра-ниско прикрепване

Тези продукти позволяват на изследователите да създадат стабилни и възпроизводими чернодробни сфероидни модели за откриване на лекарства, токсикология, моделиране на заболявания и транслационни изследвания.

Заключение

Тъй като регулаторните агенции все повече насърчават съответни стратегии за тестване при хора, 3D първичната хепатоцитна сфероидна култура се превръща в незаменима платформа за модерни изследвания на черния дроб.

Чрез запазване на чернодробния фенотип, подобряване на физиологичното значение и поддържане на дългосрочни функционални изследвания, първичните хепатоцитни сфероиди преодоляват празнината между конвенционалната клетъчна култура и in vivo биологията.

С високо-качествени първични хепатоцити, оптимизирана културална среда и специализирани културни плаки с ултра-ниско прикрепване, IPHASE предлага на изследователите цялостно решение за изграждане на възпроизводими, високо-ефективни 3D чернодробни модели, които ускоряват откриването на лекарства и биомедицинските изследвания.