Märksõnad:Organoid, 3D kultiveerimine, 3D sferoidkultuur, 3D rakukultuur, primaarsed hepatotsüüdid, primaarsed inimese hepatotsüüdid, primaarsed ahvi hepatotsüüdid, primaarsed koera hepatotsüüdid, primaarsed roti hepatotsüüdid, primaarsed hiire hepatotsüüdid, ülimadala kinnitusega kultuuriplaat

IPHASE tooted

Sissejuhatus

Organoid- ja 3D-rakukultuuritehnoloogiate kiire areng muudab prekliinilisi uuringuid. Kuna farmaatsiaettevõtted soovivad rohkem ennustadavitro modmuidu asendatakse traditsiooniline kahemõõtmeline (2D) rakukultuur üha enam füsioloogiliselt oluliste 3D kultiveerimissüsteemidega.

Märkimisväärne verstapost saabus 2025. aasta aprillis, kui USA FDA teatas kavast vähendada loomkatsete nõudeid monoklonaalsete antikehade ohutuse hindamiseks, samas kui enco.Uue lähenemisviisi metoodikate (NAM), sealhulgas organoidide ja täiustatud inimese rakupõhiste mudelite kasutuselevõtt. See poliitikamuutus rõhutab inimeste jaoks oluliste in vitro süsteemide kasvavat tähtsust ravimite väljatöötamisel.

Nende tehnoloogiate hulgas on primaarsest hepatotsüütide 3D-sferoidkultuurist saanud üks praktilisemaid ja laialdasemalt kasutusele võetud maksamudeleid. Lubades primaarsetel hepatotsüütidel kolmemõõtmelisteks sferoidideks koonduda, saavad teadlased säilitada maksa spetsiifilisi funktsioone pikema aja jooksul, saavutades samal ajal prognoositavamaid andmeid ravimite metabolismi, hepatotoksilisuse ja maksahaiguste uuringute kohta.

Mis on maksa organoidid ja hepatotsüütide sferoidid?

Organoidid on tüvirakkudest pärinevad kolmemõõtmelised mitmerakulised struktuurid, mis võtavad kokku looduslike elundite peamised arhitektuurilised ja funktsionaalsed omadused. Maksa organoidid on näidanud tohutut potentsiaali regeneratiivses meditsiinis, haiguste modelleerimises ja personaliseeritud ravis.

Võrreldes tüvirakkudest pärinevate organoididega, esindavad primaarsed hepatotsüütide sferoidid 3D-sferoidkultuuri lihtsamat ja hästi reprodutseeritavat vormi. Selle asemel, et nõuda keerulisi ekstratsellulaarseid maatrikseid või diferentseerumisprotokolle, agregeeruvad värskelt eraldatud primaarsed hepatotsüüdid spontaanselt ülimadalatel kinnitustingimustel, moodustades kompaktsed mitmerakulised sferoidid, säilitades samal ajal olulised maksafenotüübid.

See sirgjooneline lähenemisviis on muutnud hepatotsüütide sferoidid üheks kõige laialdasemalt kasutatavaks maksamudeliks farmaatsiauuringutes.

Miks 3D-kultuur ületab tavapärase 2D-kultuuri?

Primaarsed hepatotsüüdid kaotavad kiiresti oma diferentseeritud fenotüübi, kui neid kasvatatakse tavaliste monokihtidena. Vaid mõne päevaga langevad järsult paljud maksa spetsiifilised funktsioonid, sealhulgas: tsütokroom P450 ensüümi aktiivsus, albumiini sekretsioon, sapphappe metabolism, ravimi transporteri ekspressioon, rakkude polaarsus. Need piirangud vähendavad traditsiooniliste 2D kultuuride prognoositavat väärtust pikaajaliste toksilisuse uuringute jaoks.

Seevastu 3D sferoidkultuur taastab natiivses maksakoes leiduva kriitilise raku - rakkude interaktsiooni ja mikrokeskkonna arhitektuuri. Saadud sferoididel on parem füsioloogiline tähtsus tänu rakkude tõhustatud kommunikatsioonile, hapnikugradientidele, toitainete difusioonile ja maksa polarisatsiooni säilitamisele.

Järelikult säilitavad primaarsed hepatotsüütide sferoidid stabiilsed maksafunktsioonid pigem nädalaid kui päevi, muutes need eriti väärtuslikuks krooniliste ravimite kokkupuute uuringute jaoks.

Primaarse hepatotsüütide 3D sferoidkultuuri eelised

1. Pikaajaline funktsionaalne stabiilsus

3D primaarse hepatotsüütide sferoidkultuuri peamine eelis on maksa spetsiifiliste funktsioonide pikaajaline säilimine. Edendades ulatuslikke rakkude ja rakkude interaktsioone ja luues uuesti füsioloogiliselt olulise mikrokeskkonna, säilitavad sferoidid kriitilised maksaomadused, mis tavalistes 2D kultuurides kiiresti kaovad. Optimeeritud tingimustes säilitavad primaarsed hepatotsüütide sferoidid stabiilse albumiini tootmise, CYP450 ensüümi aktiivsuse, I ja II faasi metabolismi ning ravimi transporteri ekspressiooni rohkem kui 21 päeva. See pikendatud funktsionaalne eluiga võimaldab prognoositavamaid in vitro mudeleid ravimite metabolismi, hepatotoksilisuse hindamise ja krooniliste maksahaiguste uuringute jaoks.

2. Tõhustatud füsioloogiline tähtsus

3D-hepatotsüütide sferoidkultuuri üks peamisi eeliseid on selle võime taastada natiivse maksa mikrokeskkonna põhiomadused. Ulatuslike rakkude ja rakkude interaktsioonide ja koe sarnase kolmemõõtmelise arhitektuuri moodustumise kaudu loovad sferoidid füsioloogiliselt olulised hapniku ja toitainete gradiendid, säilitades samal ajal maksa polaarsuse ja raku funktsiooni. Selle tulemusena on primaarsetel hepatotsüütidel metaboolne aktiivsus, mis sarnaneb rohkem in vivo täheldatuga, mille tulemuseks on ravimite metabolismi, maksafunktsiooni ja ravimist põhjustatud maksakahjustuse (DILI) parem prognoosimine võrreldes tavaliste 2D ühekihiliste kultuuridega.

3. Rakendused ravimite avastamisel ja maksauuringutes

Primaarsete hepatotsüütide sferoidide suurenenud füsioloogiline tähtsus ja pikaajaline funktsionaalne stabiilsus on muutnud need väärtuslikeks tööriistadeks paljudes biomeditsiiniliste uuringute rakendustes. Neid kasutatakse laialdaselt ravimite metabolismi ja farmakokineetilistes uuringutes, hepatotoksilisuse hindamises, DILI prognoosimises, CYP induktsiooni ja inhibeerimise analüüsides ning metaboolse stabiilsuse testides. Lisaks pakuvad hepatotsüütide sferoidid tugevaid in vitro mudeleid maksahaiguste, sealhulgas mittealkohoolse steatohepatiidi (NASH), maksafibroosi ja viirushepatiidi uurimiseks. Nende võime natiivset maksafüsioloogiat paremini kokku võtta muudab need väga sobivaks ka täppismeditsiini, regeneratiivse meditsiini ja muude arenenud translatsiooniuuringute rakenduste jaoks.

Usaldusväärsete 3D-hepatotsüütide sferoidide ehitamine

Edukas 3D-sferoidkultuur sõltub kolmest olulisest komponendist:

1. Kvaliteetsed primaarsed hepatotsüüdid

Rakkude kvaliteet määrab otseselt sferoidi morfoloogia, elujõulisuse ja pikaajalise funktsiooni.

IPHASE pakub kõrge elujõulisusega külmsäilitatud primaarseid hepatotsüüte mitmelt liigilt, sealhulgas:

• Inimese esmased hepatotsüüdid
• Primaarsed ahvi hepatotsüüdid
• Koerte esmased hepatotsüüdid
• Primaarsed roti hepatotsüüdid
• Primaarsed hiire hepatotsüüdid

Kõik hepatotsüüdid läbivad range kvaliteedikontrolli, et tagada kõrge elujõulisus, ühtlane jõudlus ja partiidest partiide reprodutseeritavus.

2. Optimeeritud 3D kultuurisööde

Spetsiaalsed söötmed on olulised nii sferoidide moodustamiseks kui ka pikaajaliseks säilitamiseks.

IPHASE töövoog sisaldab:

• Hepatotsüütide sulamiskeskkond
• Hepatotsüütide 3D sferoidi moodustumise sööde
• Hepatotsüütide 3D sfääriline hoolduskeskkond

Need söötmed toetavad tõhusat agregatsiooni, säilitades samal ajal maksafunktsiooni pikema kultiveerimisperioodi jooksul.

3. Ultra-Low Attachment kultiveerimisplaadid

Usaldusväärseks sferoidi moodustamiseks on vaja kultiveerimisnõusid, mis takistavad rakkude adhesiooni.

IPHASE Ultra-Low Attachment Kultiveerimisplaadid võimaldavad hepatotsüütidel iseseisvalt koonduda ühtlasteks sferoidideks, ilma et oleks vaja rakuvälist maatriksikatet, tagades rutiinse labori töövoo jaoks suurepärase konsistentsi.

Eksperimentaalne valideerimine

Kasutades Cynomolgus ahvi primaarseid hepatotsüüte, lõi IPHASE oma optimeeritud kultuurisüsteemi abil seitsme päeva jooksul edukalt stabiilsed 3D-maksasferoidid(Joonis 1 ja 2).

Joonis 1. Tüüpilised 3D-sferoidid, mis on genereeritud IPHASE'i primaarsetest Cynomolgus Monkey hepatotsüütidest (partii K0125E069).

Joonis 2. Tüüpilised 3D-sferoidid, mis on genereeritud IPHASE'i primaarsetest Cynomolgus Monkey hepatotsüütidest (partii K0124E022).

IPHASE 3D primaarse hepatotsüütide sferoidkultuuri süsteemi toimimise täiendavaks kinnitamiseks kultiveeriti mitme liigi primaarseid hepatotsüüte, kasutades sama standardiseeritud töövoogu, sealhulgas ahvi (partii K0125E086), beagle koera (partii B0125H018) ja Sprague-Dawley roti hepatocytes hepatocytes. Albumiini sekretsiooni kultuuri supernatandis mõõdeti pärast 7-päevast sferoidkultuuri kui maksa aktiivsuse funktsionaalset indikaatorit (joonis 1). Kõik kolm liiki moodustasid edukalt stabiilsed sferoidid ja säilitasid tuvastatava albumiini tootmise, näidates IPHASE 3D kultuuriplatvormi tugevust ja reprodutseeritavust erinevatel loomamudelitel.

Sferoidide pikaajalise funktsionaalse stabiilsuse hindamiseks kultiveeriti cynomolguse ahvi hepatotsüüte (partii K0124E022) kuni 21 päeva. Albumiini sekretsiooni hinnati mitmel ajahetkel kogu kultiveerimisperioodi jooksul (joonis 2). Albumiini pidev tootmine pikaajalise kultiveerimise ajal näitab, et IPHASE 3D sferoidsüsteem säilitab tõhusalt maksa spetsiifilisi funktsioone, toetades selle rakendamist kroonilise toksilisuse uuringutes, ravimite metabolismis ja pikaajalises maksahaiguste modelleerimises.

Joonis 1. Albumiini sekretsioon 3D-sferoidide poolt, mis on genereeritud erinevate liikide primaarsetest hepatotsüütidest pärast 7-päevast kultiveerimist.
Joonis 2. Albumiini sekretsioon makaakide primaarsete hepatotsüütide sferoidide poolt, mida kultiveeriti 7 ja 21 päeva.
IPHASE täislahendus 3D-maksamudelitele

Et toetada kasvavat nõudlust täiustatud 3D rakukultuuri ja organoidiuuringute järele, pakub IPHASE integreeritud töövoogu hepatotsüütide sferoidkultuuri jaoks, sealhulgas:

• Krüosäilitatud primaarsed inimese hepatotsüüdid
• Primaarsed ahvi hepatotsüüdid
• Koerte esmased hepatotsüüdid
• Primaarsed roti hepatotsüüdid
• Primaarsed hiire hepatotsüüdid
• Hepatotsüütide sulamiskeskkond
• Hepatotsüütide 3D sferoidi moodustumise sööde
• Hepatotsüütide 3D sfääriline hoolduskeskkond
• Ultra-Madala kinnitusega kultiveerimisplaadid

Need tooted võimaldavad teadlastel luua usaldusväärseid ja reprodutseeritavaid maksa sferoidmudeleid ravimite avastamiseks, toksikoloogiaks, haiguste modelleerimiseks ja translatsiooniuuringuteks.

Järeldus

Kuna reguleerivad asutused julgustavad üha enam inimeste jaoks olulisi testimisstrateegiaid, on 3D primaarse hepatotsüütide sferoidkultuurist saamas tänapäevaste maksauuringute asendamatu platvorm.

Säilitades maksa fenotüüpi, parandades füsioloogilist tähtsust ja toetades pikaajalisi funktsionaalseid uuringuid, täidavad primaarsed hepatotsüütide sferoidid lõhet tavapärase rakukultuuri ja in vivo bioloogia vahel.

Kvaliteetsete primaarsete hepatotsüütide, optimeeritud söötme ja spetsiaalsete Ultra-Low Attachment kultiveerimisplaatidega pakub IPHASE teadlastele terviklikku lahendust reprodutseeritavate, suure jõudlusega 3D-maksamudelite loomiseks, mis kiirendavad ravimite avastamist ja biomeditsiinilisi uuringuid.