Ključne besede:Organoid, 3D kultivacija, 3D sferoidna kultura, 3D celična kultura, primarni hepatociti, primarni človeški hepatociti, primarni hepatociti opice, primarni hepatociti psov, primarni hepatociti podgan, primarni hepatociti miši, plošča s kulturo z ultra-nizko pritrditvijo

Izdelki IPHASE

Uvod

Hiter razvoj tehnologij Organoid in 3D celične kulture preoblikuje predklinične raziskave. Ker si farmacevtska podjetja prizadevajo za večjo napovedvitro modTradicionalno dvodimenzionalno (2D) celično kulturo vse bolj nadomeščajo fiziološko pomembni 3D sistemi gojenja.

Pomemben mejnik je bil aprila 2025, ko je ameriška FDA objavila načrte za zmanjšanje zahtev za testiranje na živalih za oceno varnosti monoklonskih protiteles, medtem ko encospodbujanje k sprejetju metodologij novega pristopa (NAM), vključno z organoidi in naprednimi modeli na osnovi človeških celic. Ta sprememba politike poudarja vse večji pomen sistemov in vitro, ki so pomembni za ljudi, za razvoj zdravil.

Med temi tehnologijami je primarna 3D sferoidna kultura hepatocitov postala eden najbolj praktičnih in široko sprejetih modelov jeter. Z omogočanjem primarnim hepatocitom, da se sami sestavijo v tridimenzionalne sferoide, lahko raziskovalci ohranijo specifične funkcije jeter za daljša obdobja, hkrati pa pridobijo več napovednih podatkov za presnovo zdravil, hepatotoksičnost in raziskave bolezni jeter.

Kaj so jetrni organoidi in hepatocitni sferoidi?

Organoidi so tridimenzionalne večcelične strukture, pridobljene iz matičnih celic, ki povzemajo ključne arhitekturne in funkcionalne značilnosti domačih organov. Jetrni organoidi so pokazali izjemen potencial v regenerativni medicini, modeliranju bolezni in personalizirani terapevtiki.

V primerjavi z organoidi, pridobljenimi iz matičnih celic, primarni hepatocitni sferoidi predstavljajo enostavnejšo in zelo ponovljivo obliko 3D sferoidne kulture. Namesto da bi zahtevali kompleksne zunajcelične matrike ali protokole diferenciacije, se sveže izolirani primarni hepatociti spontano združijo pod pogoji ultra-nizke pritrditve, da tvorijo kompaktne večcelične sferoide, medtem ko ohranjajo bistvene jetrne fenotipe.

Zaradi tega enostavnega pristopa so sferoidi hepatocitov postali eden najbolj razširjenih modelov jeter za farmacevtske raziskave.

Zakaj je 3D kultura boljša od običajne 2D kulture

Primarni hepatociti hitro izgubijo svoj diferenciran fenotip, če jih gojimo kot običajne monosloje. V samo nekaj dneh se številne jetrne funkcije dramatično zmanjšajo, vključno z: aktivnostjo encima citokroma P450, izločanjem albumina, presnovo žolčnih kislin, izražanjem prenašalcev zdravil, celično polarnostjo. Te omejitve zmanjšujejo napovedno vrednost tradicionalnih 2D kultur za študije dolgoročne toksičnosti.

Nasprotno pa 3D sferoidna kultura poustvari kritične interakcije med celicami in arhitekturo mikrookolja, ki jo najdemo v naravnem jetrnem tkivu. Nastali sferoidi kažejo izboljšano fiziološko pomembnost z izboljšano celično komunikacijo, kisikovimi gradienti, difuzijo hranil in vzdrževanjem jetrne polarizacije.

Posledično primarni sferoidi hepatocitov vzdržujejo stabilne funkcije jeter tedne in ne dni, zaradi česar so še posebej dragoceni za študije kronične izpostavljenosti zdravilu.

Prednosti primarne 3D sferoidne kulture hepatocitov

1. Dolgotrajna funkcionalna stabilnost

Ključna prednost 3D primarne sferoidne kulture hepatocitov je dolgoročna ohranitev jetrnih specifičnih funkcij. S spodbujanjem obsežnih interakcij med celicami in poustvarjanjem bolj fiziološko pomembnega mikrookolja sferoidi ohranjajo kritične značilnosti jeter, ki se hitro izgubijo v običajnih 2D kulturah. V optimiziranih pogojih primarni sferoidi hepatocitov vzdržujejo stabilno proizvodnjo albumina, aktivnost encima CYP450, presnovo faze I in faze II ter ekspresijo prenašalca zdravila več kot 21 dni. Ta podaljšana funkcionalna življenjska doba omogoča bolj napovedne modele in vitro za presnovo zdravil, oceno hepatotoksičnosti in raziskave kronične bolezni jeter.

2. Izboljšana fiziološka ustreznost

Ena glavnih prednosti 3D sferoidne kulture hepatocitov je njena zmožnost poustvarjanja ključnih značilnosti naravnega mikrookolja jeter. Z obsežnimi interakcijami med celicami in oblikovanjem tridimenzionalne arhitekture, podobne tkivu, sferoidi vzpostavijo fiziološko pomembne kisikove in hranilne gradiente, medtem ko ohranjajo jetrno polarnost in celično funkcijo. Posledično primarni hepatociti kažejo presnovne aktivnosti, ki so bolj podobne tistim, ki so jih opazili in vivo, kar vodi do izboljšane napovedi presnove zdravil, delovanja jeter in poškodbe jeter, povzročene z zdravilom (DILI) v primerjavi z običajnimi 2D enoslojnimi kulturami.

3. Aplikacije pri odkrivanju zdravil in raziskavah jeter

Povečan fiziološki pomen in dolgoročna funkcionalna stabilnost primarnih sferoidov hepatocitov so postali dragoceno orodje v širokem spektru aplikacij biomedicinskih raziskav. Obširno se uporabljajo v presnovi zdravil in farmakokinetičnih študijah, oceni hepatotoksičnosti, napovedovanju DILI, testih indukcije in inhibicije CYP ter preskušanju stabilnosti presnove. Poleg tega sferoidi hepatocitov zagotavljajo robustne in vitro modele za raziskovanje bolezni jeter, vključno z nealkoholnim steatohepatitisom (NASH), fibrozo jeter in virusnim hepatitisom. Zaradi njihove zmožnosti, da bolje povzamejo naravno fiziologijo jeter, so zelo primerni tudi za natančno medicino, regenerativno medicino in druge napredne translacijske raziskovalne aplikacije.

Gradnja zanesljivih 3D hepatocitnih sferoidov

Uspešna kultura 3D sferoidov je odvisna od treh bistvenih komponent:

1. Visokokakovostni primarni hepatociti

Kakovost celic neposredno določa sferoidno morfologijo, sposobnost preživetja in dolgoročno delovanje.

IPHASE zagotavlja kriokonzervirane primarne hepatocite z visoko sposobnostjo preživetja iz več vrst, vključno z:

• Primarni človeški hepatociti
• Primarni opičji hepatociti
• Primarni pasji hepatociti
• Primarni podganji hepatociti
• Primarni mišji hepatociti

Vsi hepatociti so podvrženi strogemu nadzoru kakovosti, da se zagotovi visoka sposobnost preživetja, dosledno delovanje in ponovljivost od serije do serije.

2. Optimiziran 3D kulturni medij

Specializirani mediji so bistveni tako za oblikovanje sferoidov kot za dolgoročno vzdrževanje.

Potek dela IPHASE vključuje:

• Medij za taljenje hepatocitov
• Medij za tvorbo sferoidov hepatocitov 3D
• Hepatocitni 3D sferoidni vzdrževalni medij

Ti mediji podpirajo učinkovito agregacijo, medtem ko ohranjajo delovanje jeter v daljših obdobjih kulture.

3. Plošče za kulture Ultra-Low Attachment

Zanesljiva tvorba sferoidov zahteva posode za kulturo, ki preprečujejo celično adhezijo.

IPHASE Ultra-Low Attachment Culture Plates omogočajo hepatocitom, da se sami-sestavijo v enotne sferoide, ne da bi potrebovali prevleke zunajceličnega matriksa, kar zagotavlja odlično konsistenco za rutinske laboratorijske poteke dela.

Eksperimentalna validacija

Z uporabo primarnih hepatocitov opice Cynomolgus je IPHASE v sedmih dneh uspešno vzpostavil stabilne 3D jetrne sferoide z uporabo optimiziranega sistema kulture(Slika 1 in 2).

Slika 1. Reprezentativni 3D sferoidi, ustvarjeni iz IPHASE primarnih hepatocitov opice Cynomolgus (lot K0125E069).

Slika 2. Reprezentativni 3D sferoidi, ustvarjeni iz IPHASE primarnih hepatocitov opice Cynomolgus (lot K0124E022).

Za nadaljnjo validacijo delovanja sistema za kulturo primarnih hepatocitnih sferoidov IPHASE 3D so bili primarni hepatociti več vrst kultivirani z istim standardiziranim potekom dela, vključno s hepatociti opice cynomolgus (lot K0125E086), psa beagla (lot B0125H018) in hepatocitov podgan Sprague-Dawley. Izločanje albumina v supernatantu kulture je bilo izmerjeno po 7 dneh kulture sferoidov kot funkcionalni indikator jetrne aktivnosti (slika 1). Vse tri vrste so uspešno oblikovale stabilne sferoide in ohranile zaznavno proizvodnjo albumina, kar dokazuje robustnost in ponovljivost platforme kulture IPHASE 3D na različnih živalskih modelih.

Da bi ocenili dolgoročno funkcionalno stabilnost sferoidov, smo hepatocite opice Cynomolgus (lot K0124E022) gojili do 21 dni. Izločanje albumina je bilo ocenjeno na več časovnih točkah v celotnem obdobju kulture (slika 2). Trajna proizvodnja albumina med dolgotrajno kulturo kaže, da sferoidni sistem IPHASE 3D učinkovito ohranja specifične funkcije jeter, kar podpira njegovo uporabo v študijah kronične toksičnosti, presnovi zdravil in dolgotrajnem modeliranju bolezni jeter.

Slika 1. Izločanje albumina s 3D sferoidi, ustvarjenimi iz primarnih hepatocitov različnih vrst po 7 dneh gojenja.
Slika 2. Izločanje albumina s primarnimi sferoidi hepatocitov opice Cynomolgus, gojenimi 7 in 21 dni.
Celovita rešitev IPHASE za 3D modele jeter

Da bi podprl naraščajoče povpraševanje po napredni 3D celični kulturi in raziskavah Organoidov, IPHASE zagotavlja integriran potek dela za kulturo sferoidov hepatocitov, vključno z:

• Kriokonzervirani primarni človeški hepatociti
• Primarni opičji hepatociti
• Primarni pasji hepatociti
• Primarni podganji hepatociti
• Primarni mišji hepatociti
• Medij za taljenje hepatocitov
• Medij za tvorbo sferoidov hepatocitov 3D
• Hepatocitni 3D sferoidni vzdrževalni medij
• Plošče za kulture Ultra-Low Attachment

Ti izdelki omogočajo raziskovalcem, da vzpostavijo robustne in ponovljive modele jetrnih sferoidov za odkrivanje zdravil, toksikologijo, modeliranje bolezni in translacijske raziskave.

Zaključek

Ker regulativne agencije vedno bolj spodbujajo strategije testiranja, ki so pomembne za ljudi, postaja 3D primarna sferoidna kultura hepatocitov nepogrešljiva platforma za sodobne raziskave jeter.

Z ohranjanjem jetrnega fenotipa, izboljšanjem fiziološkega pomena in podpiranjem dolgoročnih funkcionalnih študij primarni sferoidi hepatocitov premostijo vrzel med konvencionalno celično kulturo in biologijo in vivo.

Z visoko-kakovostnimi primarnimi hepatociti, optimiziranimi gojišči in specializiranimi ploščami za kulturo Ultra-Low Attachment, IPHASE raziskovalcem ponuja popolno rešitev za izdelavo ponovljivih, visoko-zmogljivih 3D modelov jeter, ki pospešujejo odkrivanje zdravil in biomedicinske raziskave.